分装后置冰浴内备用。
[0027] 3. 9、连接产物的转化：取上述连接产物5 μ 1加入100 μ 1感受态细胞，冰浴60 分钟，42 ° C热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9 ml，37 ° C振荡培养1小时，取200 μ 1涂布于含氨苄青霉素的LB平皿上（15cm直径)。37 ° C 培养16小时，每个LB平皿用5 ml LB液体培养基洗涤菌落，加10%的甘油于液氮保存的所 构建中华大蟾蜍毒腺cDNA文库大约含I. 8X IO5个克隆。
[0028] 4、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的基因克隆。
[0029] 采用cDNA文库构建质粒pSPORT 1的通用引物T7启动子序列 (5, -TAATACGACTCTATAGGGA-3'）（SEQ ID No: 5)以及 SP6 启动子序列（5, -CATACGATTTA GGTGACACTATAG-3'）（SEQ ID No:6)鉴定每个克隆的插入片段大小。通过对2000多个插 入片段>400 bp的克隆的测序，结合核酸及蛋白质的序列比较，得到了中华大蟾蜍抗菌肽 BG-CATH37的编码基因，如图1所示，其cDNA自5'端至3 '端序列为（SEQ ID N0:1): AGTGGAGTGCGGAGAGGACATTTCCTCTAAGACAGGCCAAGATGAGGAGCTGGTGGCTGTCTCTGCTGCTC GTCTCTGCTGTCACATTACACGGCTGTCTCTCTGACACTGCAGAGCCTGAGGTCCAAGATGGAAGATCTGTAGGAG ATGTCATCGACCTCTACAACCAGAGGGAGGGGGTCACATACTTATATAAATCCCTGGACCAGCTGCCCCCTGTTCCA ATGGAGGAAGATGAAAATCCGAACAGAAGAGGCTTTATCATTAAAGAGACGGTGTGCCTCAAATCCGAGAATCCTGA TTTAACCCAGTGTGATTTCAAGCCCGACGGAGATGTGAAGATCTGTTCTCTGGATTTGGATGATGAGGATCCTGAGG ACATAATGTGCACCAGTCTGAACAAGGAGGTTCGTGTGAAGCGGTCCAGCAGAAGACCATGCAGGGGGAGGTCCTGC GGGCCGCGGCTAAGAGGAGGTTATACTCTTATCGGCAGACCCGTTAAAAACCAAAACAGACCTAAGTACATGTGGGT GTAAAGATCTGCAGTCAACAGTAGAACGAGATCTGAGATTGAGGCTTATGACAAGCACATTACCGTTATAAGCTTTA CTAGTTATTATTATGAGGTGCGAGGTGGCACATTGCGAATACCTCCTTACTTCTTCTGACCTCTCCCATCTTCACTC TAATCCCCGGAGGAGAGATTTCAGGAGTTTCAGCTTGCTATGAGATCAGCCATGTTCTGTCTGTGGAACGTTCTGAA TGGATACAATGTTACAAATAAACGTAGCAACAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID N0:1的核苷酸序列编码的抗菌肽前体蛋白氨基酸序列为（SEQ ID N0:2): MRSWWLSLLLVSAVTLHGCLSDTAEPEVQDGRSVGDVIDLYNQREGVTYLYKSLDQLPPVPMEEDENPNRRG FIIKETVCLKSENPDLTQCDFKPDGDVKICSLDLDDEDPEDIMCTSLNKEVRVKRSSRRPCRGRSCGPRLR GGYTLIGRPVKNQNRPKYMWV 〇
[0030] 从上述前体蛋白的序列分析，根据目前对抗菌肽成熟肽加工位点的知识和抗菌肽 结构理论，该短肽有两种切割方式。大部分两栖类抗菌多肽在正常pH环境下带净正电荷， 分子结构中含有多个赖氨酸（K)或者精氨酸（R)，第一种蛋白切割方式，Leu25-Trp42为中 华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37 的成熟序列（SEQ ID N0:3，SSRRPCRGRSCGPRLRGGYTLIGRPVKNQNR PKYMWV)。抗菌肽BG-CATH37由37个氨基酸组成，理论pi值为12. 00,分子量Mw 4302. 08Da。
[0031] 第二种切割方式，Pix)29-Trp42为中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH (5-37)的成熟序列 (SEQ ID N0:4，PCRGRSCGPRLRGGYTLIGRPVKNQNRPKYMWV)。抗菌肽 BG-CATH3(5-37)由 33 个 氨基酸组成，理论Pl值为12. 00,分子量Mw 3815. 54Da。
[0032] 实施例2、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37、BG-CATH (5-37)的制备 1、根据编码中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37、BG-CATH (5-37)的核酸序列推导出成熟抗 菌肽的氨基酸序列。分别用全自动多肽合成仪合成它们对应的全序列。通过HPLC反相C18 柱层析脱盐、纯化。
[0033] 2、分子量测定采用快原子轰击质谱法（Fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)，以甘油：间硝基节醇：二甲亚砜（1:1:1，V:V:V，体积比）为底物， Cs+作为轰击粒子，电流为1 μ A，发射电压为25 Kv。
[0034] 3、纯化的中华大蟾蜍抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定 采用快原子轰击质谱法，用全自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0035] 所合成中华大蟾蜍抗菌肽的名称以及氨基酸序列如下所示： BG-CATH37 (SEQ ID NO:3) ：SSRRPCRGRSCGPRLRGGYTLIGRPVKNQNRPKYMWV ； BG-CATH (5-37) (SEQ ID N0:4):PCRGRSCGPRLRGGYTLIGRPVKNQNRPKYMWV。
[0036] 实施例3 取待测菌株大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、、绿脓杆菌以及嗜水气 单胞菌先过夜培养，然后接种到新鲜的LB培养基中，37°C、60转/分钟培养培养4-5小时， 检测0D600?1，然后4000g离心5分钟，用灭菌的去离子水清洗并替换LB培养基。最后 稀释到大约l〇~5cfu/ml的细菌浓度。随后在干净的96孔板中，每孔加入50ul上述的细菌 浓度的菌液和50ul不同浓度的样品或空白对照的混合液，用于检测的样品不同浓度梯度。 lmg/ml的头孢作为阳性对照，阴性为灭菌的去离子水。然后37°C作用3小时。随后加入 IOOul新鲜的LB培养基，37°C培养14-16小时，然后酶标仪检测0D600来估计最低抑制率 (MIC)或接入到LB琼脂平板上，37°C培养14-16小时，来估计最低抑制率(MIC)。
[0037] 表1待测菌株的最低抑制浓度（MIC)
【主权项】
1.中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37,其具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
2.中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH(5-37)，其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的蛋白前体，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的蛋白前体的编码基因，其特 征在于：使用17启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因， 所述17启动子序列为5' -TAATACGACTCTATAGGGA-3' ； 所述SP6启动子序列5' -CATACGAITTAGGTGACACTATAG-3'。
6.权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37在制备用于抑菌、抗肿瘤的药物中 的应用。
7.权利要求2所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH(5-37)在制备用于抑菌、抗肿瘤的药 物中的应用。
8.根据权利要求7所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH(5-37)在制备用于抑菌、抗肿瘤 的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG-CATH(5-37)对嗜水气单胞菌抑制效果最好。
【专利摘要】本发明提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37、BG-CATH(5-37)及其编码基因和应用，所述抗菌肽BG-CATH37具有序列表 SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH3(37)、BG-CATH(5-37)具有显著的抑菌、抗肿瘤作用，且具有结构简单、人工合成方便特点。它可以应用于抑菌、抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。
【IPC分类】A61P35-00, A61P31-04, A61K38-17, C12N15-12, C07K14-46
【公开号】CN104530209
【申请号】CN201410778613
【发明人】高媛媛, 孙同毅, 李文辉
【申请人】潍坊医学院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月17日