一种诊断结核病的特异性抗原蛋白及其在制备诊断试剂盒中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于结核病诊断试剂技术领域，具体而言，涉及一种诊断结核病的特异性 抗原蛋白及其在制备诊断试剂盒中的用途。
【背景技术】
[0002] 结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一，结核病是当今世界上成 年人中的主要传染病，已对国际公共卫生构成严峻挑战（[l]Khasnobis S. ,Escuyer V. E. , Chatterjee D. Emerging therapeutic targets in tuberculosis:post-genomic era. Exper Opin.Ther. Targets, 2002, 6:21 ?40)。据 WHO 报告：全球己受到结核菌感染 者约20亿人，现有肺结核病人约2000万，每年新发病例800?1000万，每年死于结核病约 300万，相当于每10秒钟就有一个人死于结核病。结核菌在感染人体以后，多处于潜伏状态 或持续感染状态，它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一 种微妙的平衡，感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下，10%的感染者将发展 为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人，一年能传染10?15人。
[0003] 回顾近五十年来全球结核病斗争历程，结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗 水平与研宄均有长足的进步。由于有效化疗药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺 丁醇等）的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广，使得结核病的发病率曾一度降低，以至 于人们乐观地认为，结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期，由于过分乐 观的估计形势，减少投资、缩减机构，放松对结核病的治疗与管理，结核病又在许多国家死 灰复燃，发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于"全球紧急状态"，并 呼吁"迅速采取行动与结核病危机进行斗争"，这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。
[0004] 值得注意的是，全球90%的结核病病人在发展中国家。世界性的艾滋病流行不仅 增加结核病内源性复燃的发病机会，也增加了外源性再感染的危险，加速了结核病疫情的 恶化。据WHO流行病学报告：结核病是HIV(+)者的第一杀手（32%)。耐药及耐多药结核 病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。中国是世界上结核病疫情负担最重的22 个国家之一，结核病人数仅次于印度而居世界第二，属于高流行地区，疫情呈"三高一低"， 即患病率高（523/10万）、死亡率高（20. 9/10万），耐药率高（原发耐药率28. 1 %，获得耐 药率41. 1%)、年递降率低（肺结核患病率年递降率2. 8%)。2000年第四次全国结核病流 行病学抽样调查结果表明，我国有5. 5亿人感染了结核菌，现有肺结核病人450万，其中传 染性肺结核病人200万。2005年估计有结核病患者500万人，其中80%的患者在农村。我 国每年死于结核病的人数为死于其它各类传染病人数总和的2倍以上，是中国十大致死疾 病之一。因此，有效的预防和控制结核病的发生，以及针对既有结核病的治疗就显得尤其紧 迫，刻不容缓。
[0005] 结核病的预防：WH0已将卡介苗（BCG)列入扩大免疫计划范畴。然而，针对肺结核 的免疫保护作用的报道差异甚大，从〇?80%不等。另外，随着HIV感染的流行，已有报告 AIDS病人接种BCG后引起全身播散性感染。
[0006] 结核病的治疗：到目前为止结核病的治疗方法是抗生素菌治疗，是以细菌学为基 础的。化学治疗不仅是治疗和控制疾病的有力手段，而且也是结核病防治规划的重要组成 部分。成功的化学治疗与管理，将会带来疫情的改善，包括感染率、患病率及死亡率的下降。 然而，尽管这些抗结核药物能发挥一定的治疗效果，但是随之带来的副作用也是不容忽视 的，耐药、多重耐药超耐药菌株不断出现，新药研发的速度远远低于耐药的产生的速度。彻 底根除结核杆菌是世界难题。
[0007] 结核病毒诊断：主要有以下几种方法：
[0008] (一）痰菌检查：1、痰涂菌检查，痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结 核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它 虽然是诊断肺结核"金指标"但诊断率低，培养周期长。2、痰结核菌培养，结果可信度高，并 能做结核菌药敏试验，但需时6-8周，应用受到限制。
[0009] (二）X射线检查：胸部X线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部 位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部 CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般X线检查的不足。但容易与其他肺部 疾病混淆，需要专业医生确证。
[0010] (三）肺结核病免疫学诊断：1·常用的有结核菌素纯蛋白衍化物（PPD)试验，该试 验阳性是感染过结核菌的证据之一。假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳 性也有助于诊断，如38kDa及其许多包含38kDa抗原在内的融合蛋白抗原，用于体液免疫方 面的诊断，但也不可避免的出现假阳性率。3. BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周 可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。5.聚合酶链反应（PCR)，特异 性较差，优点是敏感性可达98%?100%。
[0011](四）其他检查，只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查： 可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照 片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查：均可用于观察胸腔、纵 隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查：主要用于胸 腔积液的诊断和鉴别诊断。
[0012] 在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问 题，因此迫切需要需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法，以快速、准确地诊断结核病。
[0013] 值得注意的是，结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机 体的T细胞免疫应答，分泌产生IFN- γ，后者发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫 记忆细胞，当再次与结核杆菌相遇后，会再次分泌产生IFN- γ，发挥抗结核感染作用。抗原 特异的IFN-γ产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此，如果采用结核杆菌特异的抗 原在体外刺激感染者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核杆茼抗原特异 的IFN-γ，而非结核杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-γ的量与未用抗原刺激产生 的量相近，从而实现诊断的目的。由此可见，寻找并发现结核杆菌特异性抗原，对发展新一 代的诊断试剂具有重要价值和意义。
【发明内容】
[0014] 针对现有诊断方法的不足，本发明的目的之一在于提供一种敏感性和特异性高的 结核病诊断抗原蛋白，该抗原蛋白可实现对结核病病人或早期感染者的快速、特异的诊断， 在阻断结核病的传播和流行，以及对结核病的控制具有重大意义。
[0015] 为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研宄和不懈努力，最终获得如 下技术方案：
[0016] -种诊断结核病的特异性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者是该 序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
[0017] 另外，本发明也提供了编码上述特异性抗原蛋白的DNA分子。优选地，该DNA分子 的核苷酸序列为