SEQ ID NO. 2。
[0018] 再者，本发明还提供了一种结核病的抗体，具体为能够特异性结合上述抗原蛋白 的单克隆抗体。
[0019] 由于采用的是结核杆菌特异性的抗原，只与结核杆菌感染人体后产的免疫记忆T 细胞起反应，因而产生的干扰素是结核杆菌抗原特异性的IFN-γ。采用本发明的抗原进行 刺激，结核病抗原特异的全血IFN-Y诊断的敏感性为100%，特异性高达98. 2%，能够快 速、特异性的诊断结核病。因此，本发明还提供了该抗原蛋白的新用途，即：上述的抗原蛋白 在制备诊断、预防和/或治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病（例如结核病，例如肺结核或 肺外结核）的试剂、试剂盒、疫苗或药物中的用途；或者上述的抗原蛋白在制备抗IFN-γ的 单克隆抗体中的用途。
[0020] 与现有技术相比，本发明涉及的结核杆菌特异性抗原蛋白只与结核杆菌感染人体 后产的免疫记忆T细胞起反应，因而产生的干扰素是结核杆菌抗原特异性的IFN-γ。采用 本发明的抗原进行刺激，结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断的敏感性为100%，特异性高 达98. 2%，具有良好的诊断符合率，同时采用基于工程重组技术可大规模生产，能大幅降低 患者诊断费用。因此，本发明提供的结核杆菌特异抗原对结核病的早期诊断有重要意义，具 有良好的社会效益。
【附图说明】
[0021] 图1为含有本发明抗原蛋白的表达载体pET28b结构示意图；
[0022] 图2为重组抗原蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0024] 实施例1重组抗原蛋白的表达与纯化
[0025] 人工合成抗原蛋白的DNA序列（SEQ ID NO. 2)保存于DH5a中，再用NcoI、XhoI 内切酶分别酶切DH5 a和pET28b表达载体，回收目的片断和表达载体，在T4DNA连接酶作用 下4°C连接16小时（载体构建图见图1)，用热休克法转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，37°C 培养过夜。挑取在平板生长较好的，具有典型大肠杆菌特征的菌落在液体LB培养基中培 养，同时在培养基中加入终浓度为30 μ g/ml的卡那霉素，37°C，220rpm，培养3小时，提取质 粒进行酶切和测序鉴定，酶图及测序图谱和预期相符合。挑取在平板生长较好的，具有典型 大肠杆菌特征的菌落在液体LB培养基中培养，加入终浓度为50 μ g/ml的氨苄青霉素培养 6小时，加入终浓度为0. 5mM的IPTG，37°C，200rpm，诱导表达8小时，收集菌体，按如下方 法分离纯化目标蛋白：蛋白质纯化按Ni-NTA标准操作规程进行，步骤如下，取50ml菌液离 心收集诱导表达的工程菌，用超声波将大肠破细胞，离心取上清，上清于Tris (50mM，pH8. 0) 缓冲液中透析过夜，离心取上清，直接上样于已用Tris (50mM，pH8. 0)缓冲液平衡的Ni-NTA 树脂中，用Tris (50mM，pH8. 0)缓冲液洗脱平衡后，再用O-IM的咪唑梯度洗脱，收集洗脱峰， 将洗脱峰合并，于Tris (50mM，pH8. 0)缓冲液中透析过夜，透析液于真空冷冻干燥机中冻干 即为抗原蛋白冻干粉，-20?_40°C保存备用。纯化的抗原蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定图谱 见图2,重组抗原蛋白的分子量为23. 73Kda。
[0026] 实施例2人IFN- γ检测试剂盒的制备
[0027] 采用实施例1制备的重组抗原蛋白，按标准单克隆抗体筛选方法筛选抗IFN-γ的 单克隆抗体，获得了两株针对IFN-γ的不同抗原簇的单克隆抗体，将其中一个抗体按一定 浓度包被酶标板，4°C过夜，再37°C的温度下1-2小时封闭后，将酶标板冷冻干燥后，即为商 业用酶标板，另外一株抗体按照标准方法标记生物素。将干扰素 γ标准（1 μ g/ml)按要求 稀释成标准曲线对照。根据实验要求，取合适的酶标板条，不用的酶标板或放入酶标板袋 中，4°C一 8°C继续保存，在对应孔中加入标准、阳性对照（干扰素 γ标准：lng/ml)、空白对 照及待检样品（新鲜血液培养后的上清），每孔50 μ 1，再加入生物素标记抗体，每孔50 μ 1， 混合均匀，贴上封口胶，于37°C孵育30分钟。将20倍浓缩洗涤液用纯化水或双蒸水20倍 稀释成洗涤工作液。弃去各孔中液体，每孔加入洗涤工作液250 μ 1，静置数秒后弃去，重复 5次，拍干。每孔加入亲和素标记辣根过氧化物酶100 y 1，贴上封口胶，置37°C温育30分 钟。重复洗板步骤。每孔加入底物液100 μ 1，混匀，置37°C避光温育15分钟。显色完毕 后，每孔加入终止液50 μ 1，振荡混匀，立即置酶标仪波长450nm(以空白孔调零）或双波长 450nm/630nm下测定OD值。灵敏度为lpg/ml。
[0028] 实施例3结核病诊断试剂盒的灵敏度和特异性检测
[0029] 采集50例确诊为结核病患者及20例健康未结核感染者的新鲜肝素抗凝静脉血 3ml，各取Iml全血于无菌培养板中培养，1孔中加入重组抗原蛋白（浓度为20 μ g/ml)进行 IFN- γ刺激，另一孔对照，37°C孵育20小时，离心收集上清，将上清取100 μ 1加入实施例2 制备的全血IFN-γ检测试剂盒中进行检测，数据显示诊断结核感染者的敏感性为100%， 特异性高达98. 2%，同临床诊断结果比较，本试剂盒显示良好的诊断一致性。
【主权项】
1. 一种诊断结核病的特异性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守 性变异体。
2. -种编码权利要求1所述的特异性抗原蛋白的DNA分子。
3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2。
4. 一种能够特异性结合权利要求1所述抗原蛋白的单克隆抗体。
5. 根据权利要求1所述的抗原蛋白在制备诊断、预防和/或治疗结核分枝杆菌感染所 引起的疾病的试剂、试剂盒、疫苗或药物中的用途。
6. 根据权利要求1所述的抗原蛋白在制备抗IFN-y的单克隆抗体中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种诊断结核病的特异性抗原蛋白及其在制备诊断试剂盒中的用途，该抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。采用本发明的抗原蛋白进行刺激，结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断的敏感性为100％，特异性高达98.2％，因此该蛋白可用于制备诊断、预防和/或治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病的试剂、试剂盒、疫苗或药物。
【IPC分类】A61P31-06, G01N33-569, C12N15-31, C07K14-35, A61K39-04, C07K16-24, C07K16-12, G01N33-68
【公开号】CN104530201
【申请号】CN201510051169
【发明人】陈刚
【申请人】孙丽华
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月30日