非小细胞型肺癌标志物fam107a及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程技术领域，具体地，本发明设及非小细胞型肺癌标志物 FAM107A及所述标志物在制备非小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤流行病学资料显示，肺癌己成为目前癌症死亡的首要原因，其总发病率在世 界范围内呈上升趋势。2000年全球每年新诊断的肺癌病例达120万，占恶性肿瘤总发病率 的12.3%。在己确诊的肺癌患者中，非小细胞肺癌（NS化C)患者占了 80-85%。大约70% 的患者发现时己经是mb期或者IV期。然而非小细胞肺癌诊疗水平的提高远落后于发病 率的上升，绝大多数患者就诊时己属晚期，失去手术切除的机会，非小细胞肺癌术后5年生 存率在I期患者为70%，而Ilia期则降低至30% W下。从国内外的研究进展来看，早期诊 断、早期治疗是提高肺癌治疗效果、降低死亡率的首选策略，而如何早期诊断肺癌，如何寻 找肺癌化疗过程中诱导耐药的关键机制，是目前迫切需要解决的问题。
[000引转录组学是研究活细胞在某一功能状态下所含信使RNA (Messenger RNA，mRNA)的 类型和拷贝数，反应了某一特定时间和空间细胞内所有基因的表达情况。转录组动态反应 了细胞的生长发育状态，不同生理、病理状态下W及不同细胞类型都具有细胞特异的转录 组，了解转录组是解读细胞的分子功能、组成成分及其完成的生物过程所必需的，对我们理 解生命体机体发育、疾病发生与预防都具有重要作用。
[0004] 本发明对已发表的非小细胞型肺癌高通量转录组数据进行Meta分析，获得1063 个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下调的基因599个，并利用 KEGG、GO、OMIM等各种生物学信息数据库和MATLAB等分析工具对差异表达基因进行功能分 析，进而筛选出影响肺腺癌发生发展的关键基因和重要的信号通路，另外基于数据挖掘分 析的结果，筛选出候选基因FAM107A，并进一步采用分子生物学方法证实了 FAM107A基因与 非小细胞肺癌的关系；FAM107A与非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞 肺癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供了非小细胞型肺癌致病相关基因FAM107A。
[0006] 本发明目的是提供了一种非小细胞型肺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 FAM107A基因。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0007] 进一步，所述的检测试剂盒为检测上述FAM107A表达水平的巧光定量PCR试剂盒。 优选采用引物对为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。
[000引进一步，本发明还提供了上述巧光定量PCR试剂盒使用方法。
[0009] 本发明目的是提供了一种非小细胞型肺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 FAM107A蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0010] 进一步，所述检测试剂盒为检测FAM107A蛋白的化ISA检测试剂盒。所述试剂盒中 的抗体可采用市售的FAM107A单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒还包括；HRP标记的IgG 抗体、辣根过氧化物酶、底物缓冲液、蛋白标准品、阴性对照样品BSA。
[0011] 进一步，所述检测试剂盒为检测FAM107A蛋白的胶体金检测试剂盒，所述的抗体 可采用市售的FAM107A单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层 析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T) 喷点有抗FAM107A单克隆抗体、质控区（C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
[0012] 本发明目的是提供FAM107A基因和/或FAM107A蛋白在制备非小细胞型肺癌的诊 断或者预后产品中的应用。
[0013] 为实现上述目的，本发明对已发表的非小细胞型肺癌高通量转录组数据进行Meta 分析，获得1063个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下调的基因 599个，并利用KEGG、GO、OMIM等各种生物学信息数据库和MATLAB等分析工具对差异表达 基因进行功能分析，进而筛选出影响肺腺癌发生发展的关键基因和重要的信号通路，另外 基于数据挖掘分析的结果，筛选出候选基因FAM107A。
[0014] 进而，本发明通过巧光定量PCR方法W 5例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织和 正常组织为样本验证筛选到的非小细胞型肺癌致病基因FAM107A在非小细胞型肺癌患病 病人的癌组织和正常组织的表达情况。为了实现上述目的，本发明首先分别提取了 5例非 小细胞型肺癌患病病人的癌组织和5例正常组织，对其总RNA的进行提取，设计了用于扩增 FAM107A基因的2条引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,用于扩增内参基因e-actin的2 条引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。制备了含有FAM107A基因序列的标准DNA模板，并进 行了敏感性实验。进而，采用qRT-PCR的方法比较FAM107A基因在非小细胞型肺癌组织和 正常组织中的表达水平。结果表明；qRT-PCR扩增结果稳定，其中FAM107A在正常组织中的 表达水平明显高于非小细胞型肺癌癌组织，实验结果验证了生物信息学筛选结果。进一步， 发明人在134例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织及癌旁组织中检测FAM107A基因表达情 况，结果显示132例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织中FAM107A基因表达低于癌旁组织 中的表达，准确率达98. 5%，即FAM107A基因与非小细胞型肺癌具有很好的相关性，可用于 制备非小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂。
[0015] 本发明目的是提供了一种检测非小细胞型肺癌的巧光定量PCR试剂盒及其使用 方法。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定 量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0016] 进一步，上述巧光定量PCR试剂盒组分包括；特异性引物、内参引物、巧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1， 下游引物序列为SEQ ID N0.2。所述内参引物为e-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 3,下游引物序列为SEQ ID NO. 4。所述巧光定量PCR反应液包括2XUltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer (With ROX)、Supe;rEnzyme Mix 和 RNase-Free Water。
[0017] 本发明还公开了一种检测非小细胞型肺癌的巧光定量PCR试剂盒的使用方法，巧 光定量PCR体系；上游引物；下游引物；样品RNA 10pg-100ng;2XUltralSYBR One St巧 RT-qPCR Buffer (With ROX)，Supe;rEnzyme Mix,加 RNase-Free Water 至 25 uL。巧光定量 PCR 程序；95°C lOmin 预变性，接 30-40 个循环；95°C 15s，60°C 60s。
[001引所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0019] 所述的试剂盒应用于非小细胞型肺癌FAM107A基因的定量检测，一步法巧光定量 PCR，方便快速，适用于临床检测。
[0020] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-10 2copies/ y 1，最小检出浓度为lOOcopies/y 1。
[0021] 本发明优点：
[0022] (a)本发明提供的FAM107A与非小细胞型肺癌具有很好的相关性，可用于制备非 小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂。
[002引 化）本发明提供的检测FAM107A表达水平的巧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提 取到巧光定量实验所用的整套试剂，并且采用了一步法巧光定量PCR，既方便临床使用，又 保证了结果的一致性。
【附图说明】
[0024] 图1RNA提取后凝胶电泳图
[0025] 图2巧光定量扩增曲线图
[0026] 图3巧光定量溶解曲线图
[0027] 图4FAM107A基因在癌组织及正常组织中相对表达量图
【具体实施方式】
[002引下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可W理解；在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 W对该些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0029] 实施例1非小细胞型肺癌组织及正常组织FAM107A基因表达情况
[0030] 一材料和方法
[0031] 1、材料
[0032] 收集5例非小细胞型肺癌癌组织及5例正常组织，对其进行分组及编号。
[0033] 2、方法
[0034] 2. 1非小细胞型肺癌组织及正常组织总RNA的提取
[0035] 按康为世纪超纯RNA提取试剂盒扣Itrapure RNA Kit值化se I)，货号CW0597)说 明书提取非小细胞型肺癌组织及正常组织的RNA，结果见图1所示，凝胶电泳显示RNA的完 整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
[0036] 采用超纯RNA提取试剂盒（货号CW0597)提取，主要操作步骤如下；
[0037] 1.样品处理，30-50mg组织在液氮中充分研磨后加入1ml Buffer化T，或在组织样 品中加入1ml Buffer化T后匀浆处理。
[003引 2.样品中加入Buffer化T后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟， 使蛋白核酸复合物完全分离。
[0039] 3. W每1ml Buffer化T加入200 氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡 15秒，室温放置2分钟。
[0040] 4. 4°C 12, 000巧m(~13, 400Xg)离屯、10分钟，此时样品分为S层；红色有机相， 中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离 屯、管（自备）中。
[0041] 5.在得到的水相溶液中加入等体积的70%己醇（无RNase的水配制），颠倒混匀。
[0042] 6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2ml)的吸附柱 (Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12, 00化pm离屯、20秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[00创 7.向吸附柱中加入350 Buffer RW1，12, 000巧m离屯、20秒，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0044] 8.配制面ase I混合液：取52 y 1 RNase-Free Water,向其中加入 8 y 110 X Reaction Buffer 和 20 y 1 面ase I (1U/ y 1)，混匀，配制成终体积为 80 y 1 的反 应液。
[0045] 9.向吸附柱中直接加入80 y 1面ase I混合液