高通量测序文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及高通量测序领域，具体而言，设及一种高通量测序文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 基因突变的方式有多种，包括SNP、插入、缺失、融合等情况。其中SNP、插入和缺失 突变类型往往从DNA水平上就可W检测得到，而发生融合突变通常需要在RNA水平上才能 检测到。
[0003] 目前，针对DNA水平（SNP、插入、缺失）的基因突变检测方法主要有ARMS (突变扩 增阻滞系统）和Sanger测序法。ARMS ;利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA 互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引 物3'碱基与模板碱基互补配对时才能出现目的PCR扩增带，从而检测出突变。该法检测样 本有限，易受污染，且假阳性率高。Sanger测序法：依据双脱氧末端终止法，反应体系中合 成W共同引物为5'端，W双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。根据片段3' 端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。该法灵敏度较低，且实验操作较 为复杂、实验周期较长、易受污染，并且检测样本数据有限。
[0004] 针对RNA水平（融合）的基因突变的检测方法主要有RT-PCR法和FI甜（巧光原位 杂交技术）。RT-PCR法；RT-PCR法一般分为两步；先将待检测标本的mRNA逆转录为cDNA， 再结合特异性引物对目标片段进行巧光PCR扩增，根据扩增片段的大小来检测是否存在融 合。该法操作复杂，易受污染，检测样本有限，只能检测已知突变类型。FISH;是利用巧光标 记的特异核酸探针与细胞内相应的祀分子杂交，通过在巧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下 观察巧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结 合了巧光探针的祀分子在染色体或其他细胞器中的定位。该法成本高，技术难度较大，检测 样本有限。
[0005] 由于在同一基因内，有可能仅发生上述一种类型的突变，也有可能同时具有两种 或两种W上的突变类型。上述检测方法往往一次只能检测一个样本的一种类型变异，无法 同时应对多样本、多基因、多检测类型的需求。然而，新兴的二代高通量测序技术为多基因、 多类型突变的平行获取带来了希望。基于多重PCR的高通量测序方法能够在提高通量的同 时节省样品降低成本，能实现数十个、百个甚至数千个位点的快速测序及低频率等位基因 的检测。
[0006] 和其它高通量测序方法相比，基于多重PCR的高通量测序方法的难点就在如何提 供一种适合进行多个目的片段、多个基因同时进行扩增的多重PCR的引物混合物。由于设 及的引物对较多，众多引物对混合在一起进行PCR扩增时容易相互之间产生影响，导致引 物二聚体的增加、扩增效率和特异性下降W及非特异性目的片段的扩增，从而导致无法同 时扩增得到多个目的片段。因而，在基于多重PCR的高通量测序方法所带来的优势已经被 众人所知时，其在多基因、多片段的多种突变类型的平行获取方面的应用却仍然受到限制。
[0007] 因此，如何有效地利用上述基于多重PCR的高通量测序方法来进行多样本、多基 因、多突变类型的平行获取，是目前亟待解决的一个技术问题。
【发明内容】
[000引本发明的主要目的在于提供一种高通量测序文库的构建方法，提供一种能够对多 样本、多基因、多突变类型进行平行获取的方法。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种高通量测序文库的构建 方法，该文库构建方法包括W下步骤；S1，利用引物混合物对多个目标区域进行多重PCR， 得到多个目标片段；S2,对多个目标片段接头连接，得到多个带接头的目标片段；W及S3， 对多个带接头的目标片段进行乳液PCR，得到高通量测序文库；其中，引物混合物为cDNA引 物混合物和/或DNA引物混合物；当混合引物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物包括 SEQ ID NO ;1 和 SEQ ID NO ;2 所示的第 1 对引物 W及 SEQ ID NO ;3 和 SEQ ID NO ;4 所示 的第2对引物；当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物包括SEQ ID NO ;5和SEQ ID NO ;6所示的第3对引物W及SEQ ID NO ;7和SEQ ID NO ;8所示的第4对引物。
[0010] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQ ID NO ;9 和SEQ ID NO ;10所示的第5对引物、SEQ ID NO ;11和SEQ ID NO ;12所示的第6对引物W 及SEQ ID NO ;13和SEQ ID NO ;14所示的第7对引物。
[OCm] 进一步地，当混合引物为DM引物混合物时，DM引物混合物还包括SEQ ID NO ; 15 和SEQ ID NO; 16所示的第8对引物、SEQ ID NO; 17和SEQ ID NO; 18所示的第9对引物、 SEQ ID NO ; 19 和 SEQ ID NO ;20 所示的第 10 对引物、SEQ ID NO ;21 和 SEQ ID NO ;22 所示 的第11对引物、SEQ ID NO ;23和SEQ ID NO ;24所示的第12对引物、SEQ ID NO ;25和SEQ ID NO ;26所示的第13对引物W及SEQ ID NO ;27和SEQ ID NO ;28所示的第14对引物。 [0012] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQ ID NO ;29 和SEQ ID NO ;30所示的第15对引物、SEQ ID NO ;31和SEQ ID NO ;32所示的第16对引 物、SEQ ID NO ;33 和 SEQ ID NO ;34 所示的第 17 对引物、SEQ ID NO ;35 和 SEQ ID NO ;36 所示的第18对引物、SEQ ID NO ;37和SEQ ID NO ;38所示的第19对引物、SEQ ID NO ;39 和SEQ ID NO ;40所示的第20对引物W及SEQ ID NO ;41和SEQ ID NO ;42所示的第21对 引物。
[001引进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQ ID NO ;43 和SEQ ID NO ;44所示的第22对引物、SEQ ID NO ;45和SEQ ID NO ;46所示的第23对引 物、SEQ ID NO ;47 和 SEQ ID NO ;48 所示的第 24 对引物、SEQ ID NO ;49 和 SEQ ID NO ;50 所示的第25对引物、SEQ ID NO ;51和SEQ ID NO ;52所示的第26对引物、SEQ ID NO ;53 和SEQ ID NO ;54所示的第27对引物W及SEQ ID NO ;55和SEQ ID NO ;56所示的第28对 引物。
[0014] 进一步地，当混合引物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQ ID NO ;57 和SEQ ID NO ;58所示的第29对引物、SEQ ID NO ;59和SEQ ID NO ;60所示的第30对引 物、SEQ ID NO ;61 和 SEQ ID NO ;62 所示的第 31 对引物、SEQ ID NO ;63 和 SEQ ID NO ;64 所示的第32对引物、SEQ ID NO ;65和SEQ ID NO ;66所示的第33对引物、SEQ ID NO ;67 和SEQ ID NO ;68所示的第34对引物W及SEQ ID NO ;69和SEQ ID NO ;70所示的第35对 引物。
[0015] 进一步地，当混合引物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物还包括SEQ ID NO ; 71和SEQ ID NO ;72所示的第36对引物W及SEQ ID NO ;73和SEQ ID NO ;74所示的第37 对引物。
[0016] 进一步地，在步骤S1之后，W及步骤S2之前，方法还包括对多个目标片段两端的 引物序列进行消化的步骤。
[0017] 进一步地，在步骤S1中，当采用cDNA引物混合物对多个目标区域进行多重PCR 时，多重PCR的条件为；第一步；96~99°C预变性2~4min ;第二步；96~99°C变性15~ 20s ;第S步；58~60°C退火延伸4~5min ;然后第二步至第S步循环28~32次，最后， 4-10 °C 保温。
[0018] 进一步地，在步骤S1中，当采用DNA引物混合物对多个目标区域进行多重PCR时， 多重PCR的条件为；第一步；96~99°C预变性2~4min ;第二步；96~99°C变性15~20s ; 第S步；58~60°C退火延伸4~5min ;第二步至第S步循环18~25次，最后，4-10°C保温。
[0019] 应用本发明的技术方案，通过采用cDNA引物混合物进行多重PCR，能够同时得到 ALK基因上的2个目的片段；通过采用DNA引物混合物进行多重PCR，能够同时得到BRAF和 PIK3CA两个基因上的2个目的片段。当分别采用上述cDNA引物混合物和DNA引物混合物 进行多重PCR时，可W对上述得到的4个目的片段同时进行后续的文库构建，因而可W通过 基于多重PCR的高通量测序方法进行上述3个基因的3个位点进行检测。相比现有技术中 对上述基因的不同位点进行检测时仅能通过单次扩增分别进行检测的方法，本发明所提供 的上述高通量测序文库使得对上述基因的检测能够通过高通量测序的方法进行多基因、多 位点的平行获取和检测，大大提高了检测通量和检测效率。
【附图说明】
[0020] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0021] 图1示出了根据本发明典型实施方式中的文库构建流程示意图；
[0022] 图2示出了现有技术和本发明的引物单独扩增W及混合后扩增的效果图；W及 [002引图3示出了根据本发明的优选实施例中33对DNA引物混合物