一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域中DNA多态位点的检测方法，具体说是一种快速检测 不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法。
【背景技术】
[0002] 线粒体是动物细胞的动力工厂，机体内90% W上的能量都是由线粒体内膜呼吸链 复合体氧化磯酸化合成的ATP提供。线粒体基因组（mitochon化ial genome，mtDNA，线粒 体DM)是动物体内唯一长期、稳定存在的核外基因组。动物线粒体基因组因其在世代间没 有基因重组、呈现严格母系遗传、拷贝数高等特点，被广泛用于动物起源进化、物种鉴定、疾 病诊断、衰老、抗病力W及动物经济性状的研究与应用。
[0003] 线粒体基因组多态分析是开展线粒体功能相关研究与应用的前提。目前，线粒体 基因组多态分析没有系统的方法报道，特别是缺少针对不同群体（品种）间的线粒体基因 组多态分析方法。针对线粒体基因组多态分析方法，目前使用较为广泛的是利用线粒体基 因组覆盖引物的PCR测序技术，即针对来自不同母系的个体，逐一进行线粒体基因组分段 引物的PCR扩增及PCR产物的测序。该方法存在两个缺陷：一是该方法费时、费力，需要大 量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操作；二是更为关键的缺陷，该方法没有考虑核线粒体 假基因可能存在的干扰，因此在检测DNA多态的结果上存在假阳性的风险，即可能导致对 线粒体基因组多态的分析出现错判。
[0004] 核线粒体假基因（Nuclear mitochon化ial pseudogen，NUMT)是线粒体基因组 (线粒体DNA)序列在物种进化过程中插入到核基因中的DNA片段。自1967年第一次通过 核DNA和mtDNA杂交在小鼠肝脏中发现NUMT W来，几乎所有的高等动物核基因组都发现 了 NUMT的存在。通常情况下，利用常规PCR和通用引物会将mtDNA和NUMT的祀序列共扩 增出来，导致mtDNA多态检测出现假阳性的结果。例如，mtDNA条形码是为了快速鉴定物种 而设计的一小段标准基因序列作为物种特异标记，比如说选择物种保守基因C0I作为一个 DNA条形码，但是在此序列存在NUMT的对应序列，如果引物设计不当，很容易导致mtDNA与 NUMT的共扩增而不能有效鉴定物种来源（Moulton et al. ,2010)。另一个典型的例子是 mtDNA突变与Alzheimer' S疾病之间的关系，同样也是因为有NUMT的存在而影响了对该 mtDNA突变的判断（Wallace et al. ,1997)。该两个例子都说明了 NUMT已经成为mtDNA多 态研究的影响因素。所W，有效排查NUMT是开展mtDNA研究必要的环节。
[0005] 因此，开展线粒体功能相关研究与应用需要建立一整套系统的群体（品种）间线 粒体基因组多态分析的技术方法，同时，群体（品种）内线粒体基因组多态检测技术也需要 完善（排查NUMT)，现行方法中大量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操作也需要从分析策 略上加W改进。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测不同品种猪线 粒体基因组多态位点的方法，运用全基因组测序策略，采用DM混池测序技术，通过线粒体 基因组覆盖引物设计、NUMT排查、基因组混池构建、PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分 析，建立了一整套线粒体基因组多态分析的方法，既排除了 NUMT对线粒体基因多态分析的 潜在干扰，获得了真实的线粒体基因组多态信息，又能高效、便捷地获得品种内、品种间的 多态倍息。
[0007] 为达到W上目的，本发明采取的技术方案是：
[000引一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在于，包括如下 步骤：
[0009] 步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计；
[0010] 步骤2, NUMT排查，得到覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物；
[0011] 步骤3，基因组混池构建；
[001引步骤4, PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。
[0013] 在上述技术方案的基础上，步骤1中，参照已有线粒体基因组序列，设计线粒体基 因组PCR引物，所述线粒体基因组PCR引物扩增覆盖线粒体基因组片段，且保证每对引物在 扩增单一 DNA模板（样品）时只特异扩增mtDM片段，无测序套峰出现。
[0014] 在上述技术方案的基础上，步骤2中，用步骤1设计的线粒体基因组PCR引物分别 对单一 DNA模板（样品）进行扩增和PCR产物测序，其中：
[0015] 扩增片段应为单一特异条带，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至出现单 一特异条带；
[0016] PCR产物的测序结果应为特异峰图，无套峰出现，否则需要优化扩增条件或重新设 计引物直至无测序套峰出现；
[0017] 同时满足扩增片段为单一特异条带和PCR产物的测序结果为特异峰图，即得到所 需的覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物。
[0018] 在上述技术方案的基础上，步骤3中，采用DNA混池测序技术，将不同母系来源的 猪基因组DNA样品浓度标定为10化g/ y L，并等量混合，每个混池的最大样本量为20个。
[0019] 在上述技术方案的基础上，步骤4中，使用步骤2得到的覆盖全线粒体基因组的特 异PCR引物进行扩增、测序及序列比对分析，从而获得品种内、品种间多态位点。
[0020] 在上述技术方案的基础上，品种内多态通过混池测序出现的套峰直接获得；品种 间多态的查找方法为；W单字母定义品种内多态类型，规则为；R表示A+G，Y表示C+T，M表 示A+C，K表示G+T，S表示C+G，W表示A+T ;通过定义字母替代碱基多态类型即可获得品种 特异的线粒体基因组定义DNA序列，通过比对不同品种的定义序列，即可获得品种间多态 位点。
[0021] 本发明所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，简便、快捷、准 确，具有W下优点：
[0022] (1)本发明建立了一整套获得不同群体（品种）线粒体基因组多态检测的分子生 物学方法，包括品种内和品种间线粒体基因组多态的检测方法。
[0023] (2)建立了系统的品种内线粒体基因组多态的检测方法，包括线粒体基因组引物 的NUMT排查步骤，从而避免了 NUMT共扩增而出现假阳性的潜在风险，为获得真实线粒体基 因组多态提供了保障，并采用DNA混池测序技术获得线粒体基因组多态信息，提高了实验 检测效率，降低了实验费用。
[0024] (3)利用单字母定义品种内多态类型的设计，建立了品种间线粒体基因组多态的 分析方法。
[0025] 本发明所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，具有社会效益 及经济效益。
[0026] 1、社会效益：线粒体基因组多态在动物起源与进化、群体遗传结构分析、疾病、经 济性状（产奶量、日增重、肉质、繁殖、抗病力等）等领域的研究与应用紧密相关。本发明是 真实检测动物群体线粒体基因组多态的有效方法，对开展动物线粒体基因效应分析、群体 遗传结构、起源、进化的研究具有重要的现实意义。
[0027] 2、经济效益：本发明具有简便、经济的特点。针对1个具有20个实验样本（混池 的最大实验样品量），与常规检测方法相比，在不考虑相同的支出费用的情况下值NA提取、 线粒体基因组覆盖引物合成），本方法的检测费用仅为常规方法的1/20 (见下表）。如果检 测样本量或检测群体增加，本方法的优势将更加明显。因此，本方法具有操作简便、费用低 廉的优点。
[002引本发明与常规方法的成本核算（相同的支出的费用没有罗列）
[0029]
【主权项】
1. 一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在于，包括如下步 骤： 步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计； 步骤2, NUMT排查，得到覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物； 步骤3,基因组混池构建； 步骤4, PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。
2. 如权利要求1所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在 于：步骤1中，参照已有线粒体基因组序列，设计线粒体基因组PCR引物，所述线粒体基因组 PCR引物扩增覆盖线粒体基因组片段，且保证每对引物在扩增单一 DNA模板（样品）时只特 异扩增mtDNA片段，无测序套峰出现。
3. 如权利要求1所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在 于：步骤2中，用步骤1设计的线粒体基因组PCR引物分别对单一 DNA模板（样品）进行扩 增和PCR产物测序，其中： 扩增片段应为单一特异条带，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至出现单一特 异条带； PCR产物的测序结果应为特异峰图，无套峰出现，否则需要优化扩增条件或重新设计引 物直至无测序套峰出现； 同时满足扩增片段为单一特异条带和PCR产物的测序结果为特异峰图，即得到所需的 覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物。
4. 如权利要求1所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征 在于：步骤3中，采用DNA混池测序技术，将不同母系来源的猪基因组DNA样品浓度标定为 IOOng/ μ L，并等量混合，每个混池的最大样本量为20个。
5. 如权利要求1所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在 于：步骤4中，使用步骤2得到的覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物进行扩增、测序及序 列比对分析，从而获得品种内、品种间多态位点。
6. 如权利要求5所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在 于：品种内多态通过混池测序出现的套峰直接获得；品种间多态的查找方法为：以单字母 定义品种内多态类型，通过定义字母替代碱基多态类型即可获得品种特异的线粒体基因组 定义DNA序列，通过比对不同品种的定义序列，即可获得品种间多态位点。
7. 如权利要求6所述的快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征在 于：以单字母定义品种内多态类型，规则为：R表示A+G，Y表示C+T，M表示A+C，K表示G+T， S表示C+G，W表示Α+Τ。
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，包括如下步骤：步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计；步骤2，NUMT排查；步骤3，基因组混池构建；步骤4，PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。本发明所述的方法，运用全基因组测序策略，采用DNA混池测序技术，建立了一整套线粒体基因组多态的分析方法，既排除了NUMT对线粒体基因多态分析的潜在干扰，获得真实的线粒体基因组多态信息，又能高效、便捷地获得品种内、品种间的多态信息。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104630370
【申请号】CN201510077296
【发明人】赵兴波
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月13日