，20-30°C解育15分钟。
[0046] 10.向吸附柱中加入350 y 1 Buffer RW1，10, 000巧m离屯、1分钟，弃废液，将吸附 柱重新放回收集管中。
[0047] 11.向吸附柱中加入500 Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水己醇）， 12, 0(K)巧m离屯、20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0048] 12.重复步骤11。
[0049] 13. 12, 00化pm离屯、2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，W彻 底惊干。
[0050] 14.将吸附柱置于一个新的无RNase离屯、管（Collection Tube 1. 5ml)中，向吸附 柱的中间部位加入30-50 y 1 RNase-Free Water,室温放置1分钟，12, 000巧m离屯、1分钟， 收集RNA溶液，-70°C保存RNA，防止降解。
[0化^ 15.总3歴完整性鉴定；取2^11?歴样品在1.5%琼脂糖凝胶电泳巧0乂，15111111)， 分出区带后，邸染色，紫外灯下观察电泳区带。
[0052] 16.用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
[0化3] 2. 2FAM107A检测引物设计与合成
[0化4] 根据PCR引物设计原则，应用Premier 5. 0和增强版的OligoArchitect?软件进 行引物设计。
[0055] FAM107A的上、下游引物序列分别为；
[0化6]上游引物；5'-AGAAGAAGAAGGAGGAGCTGGAA-3' ；沈Q ID NO. 1 [0化7]下游引物；5'-TCTCTCTTCGCTGGTCAGTGTG-3' ；SEQ ID NO. 2 [0化引产物长度为18化p。
[0059] 内参0 -actin上、下游引物序列分别为；
[0060] 上游引物；5'-ACTTAGTTGCGTTACACCCTT-3' ；沈Q ID NO. 3 [006U 下游引物；5'-GTCACCTTCACCGTTCCA-3' ；SEQ ID NO. 4
[0062] 产物长度为15化p。
[0063] 2. 3定量标准曲线的建立
[0064] 标准DNA模板的制备
[00化]按照说明书，从非小细胞型肺癌组织中，利用超纯RNA提取试剂盒（货号CW0597) 提取总RNA，接着用康为世纪SuperRT cDNA第一链合成试剂盒（货号CW0741)进行逆转 录反应，具体步骤如下；1.将 RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和 RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
[0066] 2.配置反应体系，总体积为20 y 1 ;终浓度为50pg-5 y g的RNA模板、2 y 1 Primer Mix、4]il dNTP Mix、4]il RT Buffer、In ISuperRT，加 RNase-Free Water 补平到 20 yl。
[0067] 3.祸旋震荡混匀，短暂离屯、，使管壁上的溶液收集到管底。
[0068] 4. 42°C解育30-50分钟，85°C解育5分钟。反应结束后，短暂离心置于冰上冷却。
[0069] 将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2X化q MasterMix (货号CW0682)进行常 规PCR，反应体系和条件如下MasterMix 25^1、上下游引物各2yl、cDNA0. 5yg、 补平至50 y 1。反应条件为94°C预变性2min ;94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s， SOcycles ;最后 72°C延伸 2min。
[0070] 取样5 y L，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化， 将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到D册a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质 粒 DNA 采用 NanoDrop ND-1000 核酸定量仪定量（NanoDrop Technologies, Wilmington， Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备（标准DM模板浓度范围在 l〇8-l〇2copies/y 1)。
[0071] 2. 3敏感性实验
[0072] 取重组质粒按比例稀释为108、107、106、10 5、104、103、102个拷贝/^以进行巧光定 量PCR，W检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为 l〇8-l〇2copies/ y L 最小检出浓度为 lOOcopies/ y L。
[0073] 2. 4qRT-PCR 检测 FAM107A 基因表达量
[0074] 取上述5例非小细胞型肺癌组织和正常组织超纯RNA提取试剂盒（货号CW0597) 提取总RNA，进而用UltraSYBR -步法巧光定量PCR试剂盒（货号CW0660)进行RT-PCR。具 体步骤：
[0075] 1.将 RNA 模板、引物、2X叫traSYBR One St巧 RT-qPCR Buffer(With R0X)、 Supe;rEnzyme Mix 和 RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。
[0076] 2. RT-PCR 反应体系（25yl) ;2X叫traSYBR One St巧 RT-qPCR Buffer(With R0X)12. 5yl、上游引物（lOyM)O. 5yl、下游引物（lOyM)O. 5yl、5啡6巧11271116 Mix 0. 5 y 1、加 RNA 模板（终浓度为 lOpg - lOOng)、RNase-Free Water 补平至 25 y 1。
[0077] 3.祸旋震荡混匀，短暂离屯、，将溶液收集到管底。
[007引 4.将热循环仪预热到45°C，将PCR管置于热循环仪中，按W下反应条件进行反应： 反转录；45°C lOmin ;95°C lOmin 预变性，接 45 个循环；95°C 15s，60°C 60s。
[0079] 对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows 11. 5软件，相关数据采用X 2检验 和Fisher确切概率法进行处理，P < 0. 05有统计学意义；qRT-PCR反应利用Med化Ic统计 分析软件来计算。
[0080] 二结果
[0081] 实时定量PCR扩增曲线（见图2)拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应 管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本 扩增产物溶解曲线（见图3)是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR 的相对定量公式；2-ActX 100%，比较FAM107A基因在非小细胞型肺癌组织和正常组织中 的表达水平。结果显示（具体见图4) ;qRT-PCR扩增结果稳定，其中FAM107A在癌组织中的 表达水平明显低于正常组织，W上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析FAM107A 在非小细胞型肺癌组织中低表达的结果。
[0082] 实施例2非小细胞型肺癌组织及癌旁组织FAM107A基因表达情况
[0083] 一材料和方法
[0084] 1、材料
[0085] 非小细胞型肺癌取自于2005年-2010年住院病例，取134例非小细胞型肺癌癌组 织及癌旁组织，对其进行分别编号。
[0086] 2、方法
[0087] 参考实施例1中的实验方法。
[008引 二结果
[0089] 134例非小细胞型肺癌样品中，132例样品中FAM107A在癌组织中的表达水平低于 癌旁组织，仅有2例样品中FAM107A在癌组织中的表达水平与癌旁组织没有明确区别，准确 率为98. 5%，表明FAM107A基因与非小细胞型肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细 胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂。
[0090] 实施例3 -种检测非小细胞型肺癌中FAM107A基因的检测试剂盒及使用方法
[0091] RNA提取试剂；超纯RNA提取试剂盒（货号CW0597)
[00巧 巧光定量试剂；UltraSYBR -步法巧光定量PCR试剂盒（货号CW0660)
[0093]
【主权项】
1. FAM107A基因在制备非小细胞型肺癌的诊疗产品中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的非小细胞型肺癌的诊疗产品包括 用RT-PCR、基因芯片或免疫方法检测非小细胞型肺癌中FAM107A基因和/或FAM107A蛋白 的产品。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用于RT-PCR检测非小细胞型肺癌 中FAM107A基因的产品含有一对特异性扩增FAM107A基因的引物；所述的基因芯片包括与 FAM107A基因的核酸序列杂交的探针；所述用免疫方法检测非小细胞型肺癌的产品包括与 FAM107A蛋白特异性结合的抗体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增FAM107A基因的引物 上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO. 2。
5. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测非小细胞型肺癌中 FAM107A蛋白的产品为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。
6. -种检测非小细胞型肺癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基 因 FAM107A，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列 为 SEQ ID NO. 2。
7. 根据权利要求7所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性 引物、内参引物、焚光定量PCR反应液。
8. -种检测非小细胞型肺癌相关蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 检测FAM107A蛋白。
9. 根据权利要求8所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：HRP标记 的IgG抗体、辣根过氧化物酶、底物缓冲液、蛋白标准品、阴性对照样品BSA。
10. -种权利要求6-9任意一项所述的试剂盒在制备非小细胞型肺癌辅助诊疗制剂中 的应用。
【专利摘要】本发明涉及非小细胞型肺癌标志基因FAM107A及其应用。本发明对非小细胞型肺癌高通量转录组数据进行Meta分析，筛选出候选基因FAM107A，并进一步采用分子生物学方法证实了FAM107A基因与非小细胞肺癌的关系：FAM107A在癌组织中的表达水平明显低于正常组织，并且FAM107A与非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞肺癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】G01N33-574, G01N33-68, C12Q1-68
【公开号】CN104630379
【申请号】CN201510100175
【发明人】田子强, 王贵英, 李勇
【申请人】河北医科大学第四医院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年3月6日