癌症基因突变及基因扩增检测的制作方法
【专利说明】癌症基因突变及基因扩增检测 发明领域
[0001] 本发明涉及癌症突变高发基因的检测。本发明提供了基于多重PCR和高通量测序 技术的用于癌症样品的多基因、多位点突变检测的引物组、试剂盒和检测方法。所提供的检 测结果例如可用于辅助诊断或指导临床用药方案。
【背景技术】
[0002] 癌症是全球最主要的非传染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病，我国 每年因癌症死亡的人数就高达270万，其中W肺癌及胃癌、结直肠癌等消化道肿瘤最为严 重，而女性中W乳腺癌为首的妇科肿瘤也是癌症死亡的主要原因。据统计，我国肺癌的发病 率为53. 57/10万，死亡率高达45. 57/10万，均处于所有恶性肿瘤之首，胃癌则W 36. 21/10 万的发病率仅次之，而乳腺癌W 42. 55/10万的发病率处于女性肿瘤之首。
[0003] 抗肿瘤祀向药物是目前治疗癌症较为有效的一种手段，2013年全球销量前十大 药物近一半为抗肿瘤祀向药物，抗肿瘤祀向药物和其他化疗药物疗效和毒副作用都因人 而异，该是因为本质上讲，癌症是一种多基因突变造成的疾病。关键基因的突变、截断、错 位或融合等导致肿瘤发生。由于无节制增长，肿瘤细胞发生了更多的基因突变，导致肿瘤 恶性化程度加深、转移和抵抗治疗，识别个体肿瘤特异性的驱动基因突变就成了有效的选 择祀向药物应用的关键。目前NCCN(美国国立综合癌症网络）已对多种祀向药物使用作 出规定，建议其在用于肿瘤治疗前进行基因突变检测W确定是否适合用药，例如吉非替尼 (gefitinib)、曲妥珠单抗等（Trastuzum油）。
[0004] 随着科技发展，抗肿瘤药物的发展也表现出药物使用从单一到联合的趋势。W 前祀向药物W单药加化疗为主，但大多数肿瘤是多基因疾病，针对单个祀点治疗虽然能延 长生存，但很少能根治，故目前多个祀向药物的联合治疗研究越来越多，最成功的例子就是 BRAF和MEK抑巧惊U联合治疗黑色素瘤。因此，同时能快捷地检测多个药物祀点基因检测方 法就变得尤为重要，结合高通量测序的完全个体化的基因治疗也被认为是肿瘤治疗最终努 力的方向。
[0005] 常见的癌症相关基因包括下列基因：
[0006] BRAF基因编码B-Raf蛋白。BRAF基因突变常见于黑色素瘤（50% )、非小细胞肺 癌（1-3%)，结直肠癌巧-15%)、脑胶质瘤（4.0%)、卵巢癌（11%)及胃间质瘤等高发肿 瘤中，其中W 15号外显子的V600E突变尤为常见。
[0007] EGFR巧pidermal Growth Factor Rec巧tor)为表皮生长因子受体，属于受体酪氨 酸激酶（RTKs)家族。EGFR中的突变在非小细胞肺癌患者中的发生频率高达35%，主要发 生在18、19、20和21号外显子上，而又^19号外显子的9.6746_4750(16化11?64突变和21 号外显子上的P.L858R突变最为常见。此外，EGFR中的突变还见于脑胶质瘤（26% )和胃 腺癌（10%)中。EGFR中的突变可直接激活细胞下游的多种信号途径，包括与细胞存活相 关的PI3K-AKT-mT0R途径，W及与细胞增殖相关的RAS-RAF-MEK-E服途径。
[000引 KRAS基因编码K-Ras蛋白。KRAS基因突变多发于非小细胞肺癌（15-25% )、结 直肠癌（36 - 40%)、卵巢癌（14%)及甲状腺癌等肿瘤中，主要发生在第2、3号外显子上， KRAS突变可导致RAS GTP酶的组成性激活，该种激活状态不受生长因子信号的调控，该一 结果导致细胞的持续增殖，并使EGFR TKI类药物效果降低。
[0009] PIK3CA基因编码pllOa蛋白，其为组成磯脂醜-3-激酶（PI3K)的催化亚基之一。 PI3K可参与激活下游的某些重要的信号蛋白，如AKT等。PIK3CA基因的突变主要发生在第9 和20号外显子，常发生于非小细胞肺癌（1-3%)、乳腺癌（26%)、结直肠癌（10-30%)、 卵巢癌化.7% )等肿瘤中，有研究认为PIK3CA的激活突变可能和癌细胞对EGFR TKI类药 物产生抗性有关。
[0010] 肥R2(又称化bB2)基因与EGFR-样同属于受体酪氨酸激酶家族，其基因突变常见 于非小细胞肺癌（2-4%)及乳腺癌（2%)中，而其扩增突变常发生于多种肿瘤如乳腺癌 (18%)、胃癌（7~34%)、结直肠癌（3%)、食管癌（15%)及肺癌（22.8%)中。肥R2的 突变可激活细胞下游多种信号途径，包括涉及细胞存活的PI3K-AKT-mT0R途径和涉及细胞 增殖的RAS-RAF-MEK-E服途径。
[OOU]目前已有不少针对上述基因的药物，如针对EGFR基因为祀点的有吉非替 尼（gefitinib)、厄洛替尼巧rlotinib)，针对BRAF基因突变的药物有维罗非尼 (Vemurafenib)、达拉非尼（ckbrafenib)，针对肥R2基因突变或扩增的有拉帕替尼 (Lapatinib)、阿法替尼（Afatinib) W及曲妥珠单抗（Trastuzumab)等。
[0012] DNA碱基突变（包括点突变、插入突变和删除突变等）和基因扩增突变（即基因拷 贝数增加）是肿瘤细胞中最常见的两种突变方式，也是在相关药物研发中常用的祀标。目 前常见的检测多基因突变的方法主要有英光PCR法和一代Sanger测序法。英光PCR法具 有灵敏度高的特点，且技术已经成熟，应用广泛，但是每对引物只能检测一种突变，且每种 突变需要单独建立一个PCR反应体系，导致样品用量较大，且无法同时检测大量的样品或 位点；一代Sanger测序法单对引物可检测多个突变，具有成本低等特点，但每次扩增只能 使用一对引物，无法同时检测多个基因或多个样品，而且所需样品量大，且对低频突变的检 测不够令人满意。
[0013] 传统的检测基因扩增的经典方法为FISH(英光原位杂交技术），该技术有较好的 灵敏度，其最大的优点是可直观地在细胞核层面观察基因扩增情况，并且可通过英光的亮 度强弱来推测基因拷贝数的多少，但是该方法成本较高，对技术人员的操作也有较高要求， 且其结果判断容易受多种因素影响，如多倍体细胞等等。
[0014] 多重PCR技术目前在多基因多位点的扩增上有较好的应化而相比普通PCR其也 具有高效、可对模版定量或定性等优点，但其体系构建需综合目标序列的同源性和长短、引 物动力学、PCR反应条件优化等多种因素，例如目标序列的长度范围太大可能导致扩增效率 不均匀，引物浓度配比不当或者引物间形成易形成二聚体均可影响总体扩增效率或者扩增 均匀性，目前市场上或者实验中同一体系一般较少超过同时存在五至六对引物的情况，由 此可见其在技术实现上具有相当难度和要求。
[0015] 因此，仍然需要进一步开发对DNA碱基突变和基因扩增突变的检测工具，W实现 对癌症驱动基因的更有效、更准确的检测。
【发明内容】
[0016] 除非另外说明，本申请中的各个术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相 同。
[0017] 本发明基于多重PCR和高通量测序技术开发出用于同时检测样品中一个或多个 癌症驱动基因的两个或更多个外显子的多个区域突变的引物组、试剂盒和检测方法。所述 癌症驱动基因特别是BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或肥R2基因。所述突变可W是一个或 多个碱基的插入、取代和/或缺失，或基因扩增突变。
[0018] 本发明的检测引物可用于扩增8^。、66。3、1(^5、？11(3〔4和/或肥1?2基因的外显 子上的相应区域，然后将扩增的目标片段进行高通量测序，获得目标片段的序列信息，并由 此获得突变检测结果。
[0019] 因此，本发明的目的是提供用于同时检测样品中一个或多个癌症驱动基因的两个 或更多个外显子的多个区域突变的引物组；包含该引物组的试剂盒；使用所述引物组和/ 或试剂盒扩增所述癌症驱动基因或检测所述癌症驱动基因的外显子突变的方法。
[0020] 根据本发明的一个方面，提供用于检测样品中一个或多个癌症驱动基因的一个或 多个外显子的突变的引物组，包含用于在一个多重PCR中同时扩增选自BRAF、EGFR、KRAS、 PIK3CA和/或肥R2基因的一个或多个基因的一个或多个外显子的多个区域的检测引物对， 其包含选自表1引物对中的至少3对引物：
[0021] 表1检测引物对
[0022]
【主权项】
1. 用于检测样品中一个或多个癌症驱动基因的一个或多个外显子的突变的引物组，包 含用于在一个多重？〇?中同时扩增选自8狀?36?1?、1(狀5、？11(304和/或册1?2基因的一个 或多个基因的一个或多个外显子的多个区域的检测引物对，其包含选自下列引物对中的至 少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11 对、至少12对、至少13对、至少14对、或全部15对引物： 用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对，其序列如SEQ ID ΝΟ:1和2所示； 用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:3和4所示； 用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:5和6所示； 用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:7和8所示； 用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:9和10所示； 用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO: 11和12所示； 用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO: 13和14所示； 用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO: 15和16所示； 用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO: 17和18所示； 用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO: 19和20所 示； 用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID N0:21和22所 示； 用于扩增HER2基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID N0:23和24所示； 用于扩增HER2基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID N0:25和26所示； 用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID N0:27和28所示； 和/或 用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID N0:29和30所示。
2. 权利要求1的引物组，其中所述多重PCR的反应条件为99°C预热2min，每个循环 99°C变性15s，60°C退火4min，共23个循环，最后储存于KTC备用。
3. 权利要求1或2的引物组，其进一步包含用