EQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4 的 分子标记引物与杨树I号染色体上标记位点碱基序列相对应；所述序列号为SEQIDNO:5 ; SEQIDNO:6的分子标记引物与杨树VIII号染色体上标记位点碱基序列相对应；所述序列 号为SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的分子标记引物与杨树X号染色体上标记位点碱基序列 相对应。
[0019] 其中，所述的非整倍体杂交子代植株来源于不同倍性体植株间的杂交。
[0020] 特别是，所述杂交非整倍体子代植株选择杨树非整倍体杂交子代植株。
[0021] 尤其是，所述杨树非整倍体杂交子代植株的父本是三倍体银中杨（Populus albaXP.berolinensis'Yinzhong'）、三倍体毛白杨（P.tomentosa)或三倍体青杨杂种， 优选为三倍体银中杨；母本是毛新杨（P.tomentosaXP.bolleana)、银腺杨（P.albaXP. glandulosa)或青杨派树种，优选为二倍体毛新杨。
[0022] 本发明的分子标记引物的分子标记位点靠近着丝粒位置，父母本有差异且呈共显 性分离。以提取的疑似非整倍体杂交子代植株以及杂交双亲的幼嫩叶片的DNA为模板，以 分子标记引物为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；将PCR扩增产物分别进行毛细管荧光电 泳检测，对获得的等位基因峰的数目和高度进行辨认，以双亲的基因为参照，结合流式细胞 术测定结果，比较杂交子代植株等位基因的组成情况，如果位于某条染色体上的标记位点 数目超出或少于根据流式细胞术检测结果预判的子代植株倍性水平和染色体数目，则可确 定该植株为非整倍体植株，具有超数或少数的该条染色体。
[0023] 共显性分子标记可反映出等位基因在杂交子代中的分离情况，结合荧光标记分 析，可以开展等位基因的基因型分型。对于已知染色体定位的共显性分子标记（如SSR标 记）而言，通过选择靠近着丝粒的标记位点，有效减少同源重组的影响，可以利用基因型分 型结果推测对应染色体的组成。通过对相关分子标记引物数据库结合电泳检测筛选，可以 得到定位于不同染色体、靠近着丝粒位置、父母本有差异且呈共显性分离的分子标记引物。
[0024] 常规的二倍体间杂交极少见非整倍体的产生，而以多倍体作为亲本，利用多倍体 植株减数分裂过程不规律性染色体分离所形成的非整倍性配子杂交，较易获得非整倍体植 株。
[0025] 本发明以三倍体'银中杨'为父本，与母本二倍体'毛新杨'杂交，通过引物筛选并 结合毛细管荧光电泳检测，得到了位于杨树I号、VIII号和X号染色体，靠近着丝粒位置， 父母本有差异且呈共显性分离的4对SSR引物。
[0026] 本发明利用焚光标记的共显性分子标记位点分析，结合流式细胞术，对植物杂交 子代的染色体组成进行辨识，从而检测杨树非整倍体植株的存在，并进一步测定染色体构 成。本发明方法对于植物非整倍体遗传分析、分子标记技术方法判别以及指导非整倍体育 种等具有重要的理论和应用价值。
【附图说明】
[0027] 图1引物U16扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱；
[0028] 图2引物U21902扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱；
[0029] 图3引物PMGC-2607扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱；
[0030] 图4引物LG-10-1788扩增双亲及杂交子代DNA后的毛细管电泳图谱。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032] 本发明【具体实施方式】的试验材料选择如下：
[0033] 以三倍体银中杨为父本，二倍体毛新杨为母本，进行控制授粉后获得的全同胞子 代群体，随机选取其中8株作为本发明【具体实施方式】的杂交子代待检测植株（分别命名为 PG1-8)〇
[0034] 实施例1
[0035] 1、初步检测杂交子代植株的倍性水平
[0036] 取50mg待测子代植株幼嫩叶片，置于冰上，加入lmL冷藏的细胞核分离缓冲液， 其中，细胞核分离缓冲液为 45mMMgC12*6H20,20mMM0PS，30mMsodiumcitrate，0. 5% TritonX-100，l%PVP-10，pH7.0;接着用单面刀片迅速剁60s成碎片，包含细胞核的分离 缓冲液经40ym孔径纱网过滤后，向滤液中加入浓度为50yg/mLPI(PropidiumIodide，碘 化丙啶染色溶液）溶液，混合均匀，其中PI溶液中含有RNA酶，PI溶液中RNA酶的浓度为 50yg/mL，然后在冰浴中孵育染色30min，然后使用流式细胞仪（德国Partec公司，型号： CyFlowPA流式细胞仪）进行细胞核DNA含量分析。
[0037] 以双亲（即父本、母本）的细胞核作为对照。分析结果见表1。
[0038] 表1基于流式细胞检测的杂交子代植株倍性预测结果
[0039]
【主权项】
1. 一种检测非整倍体杂交子代植株的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物 为SSR引物。
2. 按照权利要求1所述的分子标记引用，其特征在于，所述分子标记引物的碱基序列 为SEQ ID NO :1 ;SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 ;SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 ;SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8所示。
3. 按照权利要求1或2所述的分子标记引物在检测非整倍体杂交子代植株中的应用。
4. 一种非整倍体杂交子代植株的检测方法，其特征是，包括如下步骤：（1)利用流式细 胞术初步评估杂交子代植株的倍性水平和染色体数目；(2)提取的疑似非整倍体杂交子代 植株以及杂交双亲植株的幼嫩叶片的DNA ;(3)以提取的DNA分别为模板，以分子标记引物 为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；(4)将PCR扩增产物分别进行毛细管荧光电泳检测， 对获得的等位基因峰的数目和高度进行辨认，确认杂交子代植株的等位基因的组成情况， 如果位于染色体上的标记位点数目超出或少于根据流式细胞术检测结果初步评估的杂交 子代植株的倍性水平和染色体数目，则可确定该植株为非整倍体植株，具有超数或少数的 该条染色体。
5. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的分子标记引物是SSR引 物。
6.按照权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述的分子标记引物的碱基序列为 SEQ ID NO ：1 ；SEQ ID NO ：2 ；SEQ ID NO ：3 ；SEQ ID NO ：4 ；SEQ ID NO ：5 ；SEQ ID NO ：6 ；SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8所示。
7. 按照权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述的非整倍体杂交子代植株来源 于不同倍性体植株间的杂交。
8. 按照权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述杂交非整倍体子代植株选择杨树 非整倍体杂交子代植株。
9. 按照权利要求8所述的方法，其特征在于，所述杨树非整倍体杂交子代植株的 父本是三倍体银中杨（Populus albaXP.berolinensis 'Yinzhong'）、三倍体毛白杨 (P. tomentosa)或三倍体青杨杂种；母本是毛新杨（P. tomentosaXP. bolleana)、银腺杨 (P. albaXP. glandulosa)或青杨派树种。
10. 按照权利要求9所述的方法，其特征在于，所述父本选择三倍体银中杨；母本选择 二倍体毛新杨。
【专利摘要】本发明公开了一种检测非整倍体杂交子代植株的方法，包括：首先初步评估杂交子代植株的倍性水平；接着以子代植株、双亲的DNA为模板，分别进行PCR扩增；然后将扩增产物分别进行毛细管荧光电泳；最后以双亲的基因为参照，结合初步评估的植株的倍性水平，对获得的等位基因峰的数目和高度进行辨认，比较子代植株等位基因的组成情况，若位于某条染色体上的标记位点数目超出或少于预期，则确定为非整倍体植株。本发明方法可对非整倍体植株进行高通量、快速、准确检测，对开展非整倍体杂交遗传改良及染色体操作研究有重要意义。与传统的染色体核型分析方法相比，具有成本低、易操作、检测速度快、可靠性强等优点，且适用于大规模群体材料的分析。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104531859
【申请号】CN201410795854
【发明人】王君, 尚峰男, 田菊
【申请人】北京林业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月18日