专利名称：带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系及其制备方法
技术领域：
本发明公开了一种稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，同时提供了构建该哺乳动物细胞系的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性和免疫调节功能的糖蛋白，在机体抗病毒天然免疫中发挥重要作用。研究表明，I型干扰素是最早诱导表达的基因，主要通过JAK-STAT信号转导途径激活一系列级联反应。一方面诱导抗病毒蛋白(如ISG蛋白、Mxl蛋白、2-5’寡聚腺苷合成酶、一氧化氮合成酶等)的表达量升高，发挥抗病毒作用，另一方面作用于受感染的细胞，激活相关基因的表达，使机体迅速处于抗病毒的防御状态，建立广泛的抗病毒防御系统。目前在基础研究和临床应用中，猪干扰素α的产生多采用大肠杆菌表达系统或酵母表达系统。采用大肠杆菌表达的信号肽序列缺失的重组干扰素_α，未经过内质网和高尔基体的加工，缺少天然的IFN-α活性，需要进行复性处理；酵母表达系统存在分泌能力低，背景杂蛋白含量高导致难以纯化，以及过度糖基化等问题。哺乳动物细胞表达系统表达产物在分子结构、生物学功能方面最接近于天然的蛋白质，但表达水平较低。本发明选择 pcDNA3.0作为载体在猪Η(15细胞中表达猪α干扰素以克服原核表达和酵母表达系统的不足，获得具有接近天然干扰素蛋白活性的基因工程干扰素。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，使猪干扰素在哺乳动物细胞中得到了表达，提供了上述哺乳动物细胞系的建立方法，能够建立带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，提供了稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，是一种带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系。本发明的技术方案是带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，所述猪干扰素α基因具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列。所述猪干扰素α基因的扩增引物具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列。带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系的制备方法，它的步骤如下
(1)利用反转录PCR方法从猪外周血白细胞中扩增猪干扰素α基因；
(2)猪干扰素α基因插入真核表达载体的多克隆位点上，得到重组表达载体
pcDNA-poIFNa ；
(3)将重组真核表达载体pcDNA-poIFNa转染并筛选出稳定表达猪干扰素α基因的细胞系。具体步骤如下
真核表达载体的构建参照GenBank上已发表的猪α干扰素基因序列Μ28623和)(57191,利用引物设计软件 Primer Premier 5. 0设计真核表达引物P3和P4，P3引物带有EcoR I酶切位点，下游引物 P4带有BioI酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段长570bp，同时用DNAstar等软件评价所设计的引物。上游弓丨物P3 5，TCTAGAATTCATGGCCCCAACCTCAG 3， 下游引物 P4:5，TACACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG 3，
PCR产物经胶回收后用EcoR I /XhoI双酶切，纯化后与pcDNA3. O载体连接，连接产物转化DH5ci感受态细胞，涂布于含Amp的琼脂平板上进行抗性筛选，挑取多个单菌落摇菌进行PCR鉴定，碱裂解法小量提取阳性质粒并酶切鉴定，测序正确后，构建成功的真核表达质粒命名为pcDNA-poIFN_a。稳定表达猪干扰素α基因的H(15细胞系的构建
采用基因工程的方法，将猪IFN-α基因插入到真核细胞表达载体多克隆位点处，得到重组表达载体。通过脂质体LipOfeCtamineTM2000介导的细胞转染以及抗生素筛选技术，筛选出可以表达猪IFN-a基因的细胞系。本发明的积极效果在于将构建的pcDNA-poIFN-a大量纯化无菌提取后，利用 Lipofectamine 2000转染H(15细胞，经G418筛选15天后，获得抗性细胞。采用一系列方法对获得的细胞在基因水平、转录水平和翻译表达水平进行鉴定，获得稳定表达猪干扰素 α基因的Η(15细胞，采用反转录PCR、实时定量PCR以及酶联免疫吸附试验(ELISA)细胞方法在Η(15细胞中检测到猪干扰素α mRNA和蛋白的表达。
图1为猪α干扰素基因PCR扩增结果，其中，Ml :DL2000Marker, 1 猪α干扰素 RT-PCR 产物。图2为pTG19-T-poIFN-a重组质粒扩增和酶切鉴定结果，其中，Ml DL15000Marker, 1 =BamH I重组质粒酶切鉴定结果，2:猪α干扰素RT-PCR产物，Μ2 DL2000Markero图3为猪α干扰素进化树分析结果。图4为猪α干扰素真核表达重组质粒PCR扩增及酶切鉴定结果，其中，Ml =DL 15000 Marker，1 猪α干扰素真核表达质粒酶切产物，2 猪α干扰素真核表达RT-PCR产物，Μ2 =DL 2000 Marker。图5为猪α干扰素ELISA检测绘制的标准曲线。图6为荧光定量PCR方法检测猪α干扰素mRNA转录水平结果。图7为重组poIFN- α在ΡΚ-15细胞中稳定表达。
具体实施例方式带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，所述猪干扰素α基因具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列。所述猪干扰素α基因的扩增引物具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系的制备方法，它的步骤如下
(1)利用反转录PCR方法从猪外周血白细胞中扩增猪干扰素α基因；
(2)猪干扰素α基因插入真核表达载体的多克隆位点上，得到重组表达载体
pcDNA-poIFNa ；
(3)将重组真核表达载体pcDNA-poIFNa转染并筛选出稳定表达猪干扰素α基因的细胞系。猪α干扰素氨基酸序列 MAPTSAFLTALVLLSCNAIYSLGCDLPQTYSLAHTRALRPLAQMRRISPFSCLDYRRDFGFPQEALGGNQVQ
KAQAMALVHEMLQQTSQLFSTEGSAAAWDDSLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEAGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHR LTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRAFSSSTNLQDRLRKKE
质粒pcDNA3. O-poIFN-α的核苷酸序列，其中944-1513位是poIFN-α基因序列 GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAA GCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAA GGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATA TACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGG AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATA ATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGC CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCT GGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACC ATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCC CATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCAT TGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACT GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTA ACGGCCGCCAGTGTGCTG^ TTCA TGGCCCCAACCTCAGCCTTCCTCACGGCCCTGGTGCTACTCAGCTGCAA TGC CATCTACTCTCTGGGCTGTGACCTGCCTCAGACCTACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCCCCTGGCACAAA TGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACTACAGAAGGGACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCAAC CAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCA TGGCTCTGGTGCA TGAGA TGCTCCAGCAGACCTCCCAGCTCTTCAGCACAGAGGG CTCAGCTGCTGCCTGGGATGACAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAG CCTGTGTCA TGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCA TCCTGGCTGTGAGGAAA TAC TTCCACAGACTCACCCTCTA TCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGA TCGTCAGGGCAGAAGTCA T GAGAGCCTTCTCTTCCTCCACAAACCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGACTCGAGCATGCATCTAGAGGGC CCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGT TGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAA TTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGG GAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAG GGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACAC TTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAA GCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGG TGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGG ATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAG TTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCA GGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTC CCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTT TTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC TAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTT CGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGC ACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGA CCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCT TGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCT CCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATC CGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTC GATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCC CGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTG GATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAA GAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTT CTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCC ATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGA TGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTAC AAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACT CATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC TAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCT GCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACT CGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGC GTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAG GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGA TACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTA GGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATC GTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGG TATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTG CGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCG GTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACG GGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAAT GCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG ATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCC AGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT ACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTAC ATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAG TGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACT GGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGA TAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGA TCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACC AGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAAT ACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAAT GTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGT SEQ ID No. 1 <110>河南农业大学
<120>带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系及其制备方法 <160> 2 <170> PatentIn Version 3.3 <210> 1 <211> 570 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (1)... (570) <400> 1
atggccccaacctcagccttcctcacggccctggtgctactcagctgcaatgccatctac60tctctgggctgtgacctgcctcagacctacagcctggctcacaccagggccctgaggccc120ctggcacaaatgaggagaatctctcccttctcctgcctggactacagaagggactttgga180ttcccccaagaggccttggggggcaaccaggtccagaaggctcaagccatggctctggtg240catgagatgctccagcagacctcccagctcttcagcacagagggctcagctgctgcctgg300gatgacagcctcctgcaccagttctgcactggactggatcagcagctcagggacctggaa360gcctgtgtcatgcaggaggcggggctggaagggacccccctgctggaggaggactccatc420ctggctgtgaggaaatacttccacagactcaccctctatctgcaagagaagagctacagc480ccctgtgcctgggagatcgtcagggcagaagtcatgagagccttctcttcctccacaaac540ctgcaagacagactcaggaagaaggagtga570
SEQ ID No. 2 <110>河南农业大学
<120>带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系及其制备方法 <160> 2
<170> PatentIn Version 3.3
7<210> 2 <211> 185 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (1)... (185) <400> 2 Met Ala Pro Thr Ser Ala 5
Asn Ala lie Tyr Ser Leu 20
Ala His Thr Arg Ala Leu 35
Pro Phe Ser Cys Leu Asp 5055
Leu Gly Gly Asn Gln
Phe Gly
Leu Thr 10
Cys Asp
Ala
65
His
Ala
Asp
Leu
Tyr
Ala
Glu Met Leu
85
Ala Ala Trp Asp 100
Gln Gln Leu Arg
Asn 70 Gln Gln
Asp Asp
115 Glu Gly 130
Phe His
Trp Glu
165 Leu Gln
Thr Pro
Arg Leu
150 lie Val
Asp Arg
Leu 135 Thr Leu
Arg Ala
170 Leu Arg
25 Arg Pro 40
Tyr Arg
Val Gln
Thr Ser
Ser Leu
105 Leu Glu 120 Leu Glu
Leu Arg Lys
Ala Leu Ala
Leu
Pro
Gln 45 Phe
Asp 60 Ala Gln
75 Gln Leu
90
Leu
Ala Glu
His Cys
Phe Gln Val
Val
Gln 30
Met
Gly Ala Ser
Leu
15
Thr
Arg
Phe
Met
Thr 95 Cys
Tyr Leu
155 Glu Val
Lys Lys
Asp
140 Gln Glu
Met Arg 175
Glu
Phe 110 Met Gln 125
Ser lie Leu
Leu
Tyr
Arg
Pro
Ala 80 Glu
Thr
Glu
Ser Ser lie Gln Leu Gly Gly Ala
Lys Ser 160 Ala Phe
Ala Val
145 Tyr Ser
Ser Ser
Cys Leu Ser Glu Val Ser Leu Gly
Arg Lys Pro Cys Ser Thr
Asn.
180185
1材料与方法 1. 1质粒、菌株和细胞株
PK-15细胞由河南农业大学兽医微生物实验室保存，于含有5%FBS的DMEM培养基中培养。宿主菌DH-5 α、真核表达载体pcDNA3. 0载体，PRRSV HeN-2株，均由本实验室保存。
1. 2试剂与仪器
RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自GIBCO公司，pTG19_T载体购自上海捷瑞公司，限制性内切酶EcoR I、XhoI、Taq聚合酶、T4 DNA Ligase均为TaKafci公司产品。DNA快速胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent购自hvitrogen公司，G418、胰蛋白酶购自Sigma公司，新生牛血清购自杭州四季青生物公司，猪α干扰素Elisa试剂盒购自R&D公司。ΕΡΧ-800酶标检测仪购自Thermo公司；S2-93自动双重纯水蒸馏器为上海亚荣公司产品；ABI荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品；细胞培养板购自美国康宁公司。1.3 引物设计参照GenBank上已发表的猪α干扰素基因序列Μ28623和 )(57191，利用引物设计软件I^rimer Premier 5. 0设计包括猪α干扰素完整开放阅读框的上、下游引物Pl和Ρ2，扩增片段为660bp，引物如下上游引物Pl :5’ CTCAGCCAGGACAGAAGC 3’，下游引物P2 :5’ GGAAGAATGGGCTTGTTAG 3’ ；设计真核表达引物扩增片段长570bp，上游引物 P3 :5’ TCTAGAATTCATGGCCCCAACCTCAG 3’，带有 EcoR I 酶切位点(下划线部分)，ATG 为起始密码子，下游引物P4 :5，TACACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG 3，，带有XhoI酶切位点(下划线部分)，TCA反向互补序列TGA为终止密码子。同时用DNAstar等软件评价所设计的引物。猪α干扰素和β-actin持家基因荧光定量PCR引物序列如下猪α干扰素上游Ρ5 5，-GGATCAGCAGCTCAGGG-3，，猪 α 干扰素下游Ρ6 :5，-GAGGGTGAGTCTGTGGAAGTA _3，，产物长度为 121 bp, β -actin 上游 Bl 5' - CGGGACATCAAGGAGAAGC- 3，，β -actin 下游 B2 5'-CTCGTTGCCGATGGTGATG- 3，，产物长度为 132 bp。1.4 目的基因IFN-α的扩增、克隆和序列测定采集猪外周血，分离淋巴细胞，采用Trizol法提取白细胞RNA，将提取的RNA进行反转录，反应体系20 μ L，RNA模板 11 μ L,dNTP (10 mmol/L)混合物 1 μ L，5X Buffer 缓冲液4 μ L，M_MuLV 反转录酶(200 U/ UL) lyL，RNase抑制剂(40 U/μ L) lyL，反转录引物Ρ2 1 μ L，混合体系在42°C下反应 lh。取反转录cDNA进行PCR，PCR扩增体系25μ L，其中iTaq DNA聚合酶8 μ L，ddH2013 μ L， Ρ1、Ρ2引物各lyL，模板3yL。PCR反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性30s，55°C退火40s，72°C延伸45s，31个循环后，72°C延伸lOmin。目的片段PCR产物回收后纯化，克隆至PTG19-T Vector，转化DH5 α感受态大肠杆菌，经蓝白斑筛选出阳性重组质粒，送上海生工公司进行序列测定。测序正确的重组质粒命名为pTG19-T_poIFN-a。1.5 真核表达载体pcDNA3. O-poIFN-α的构建
用引物P3、P4从重组质粒pTG19-T-poIFN-a上扩增目的基因，PCR反应条件同上，PCR 产物回收纯化。将pcDNA3. O空载体和目的片段用EcoR I和BioI双酶切。酶切产物经电泳鉴定并胶回收，回收产物用T4连接酶进行连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经PCR和酶切鉴定，阳性质粒命名为pcDNA3. 0-poIFN- a。1. 6 PK-15细胞的复苏
超净台紫外灯照射30min，从液氮灌中取出PK-15细胞冻存管，迅速放入37°C水浴锅中使其尽快解冻，超净台中倒出冻存管细胞悬液入提前准备好的细胞瓶中，补加10mll0%的细胞生长液，37°C 5% C02培养箱中培养。1.7 G418筛选浓度的确定
待细胞瓶中的细胞长成致密单层时，弃去废旧培养液，用0. 25%的胰酶消化，加入含 10%新生牛血清的DMEM营养液约15mL，反复吹打细胞呈单个悬浮。以2X 105个的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，待细胞长至单层达70 80%，更换新鲜培养液并分别加入终浓度为 200 μ g/ml,300 μ g/ml,400 μ g/ml,500 μ g/ml 和 600 μ g/ml 的 G418，并设置空白对照，37°C 5% C02条件下培养，每2 3d换液一次，选择出在10 14d内PK-15细胞全部死亡的最低G418浓度为最适工作浓度。1.8 重组质粒 pcDNA3. O-poIFN-α 转染 PK-15 细胞
将纯度OD26W为1. 85-1. 95的大量提纯质粒在脂质体作用下传染冊-15细胞。将生长状态良好的细胞接种6孔板，待细胞密度达60%-80%，按照Lipofectamine 2000 Reagent脂质体转染体系说明书，每孔加入质粒和转染试剂Lipofectamine Reagent以1 2.5(质量体积)的比例混合转染。染中的细胞在标准生长条件下(37°C、5%C02)培养4 6h后除去培养液与DNA沉淀，每孔加入新鲜的预热的DMEM生长培养基^iI,置37°C培养箱培养36 48h，后用G418进行筛选。同时设空质粒对照组和空白细胞对照组。1.9干扰素α在H(-15细胞中的表达及检测
1. 9. 1重组质粒pcDNA3. Ο-poIFN α转染ΡΚ-15细胞mRNA的提取重组质粒pcDNA3. 0-poIFN α转染冊-15细胞，扩大培养后，经胰酶消化收集冊_15细胞于离心管中，2000rpm lOmin，用PBS液悬浮，按TRIZOL法提取细胞总RNA，提取猪α干扰素mRNA，反转录为cDNA后，根据本实验室建立的猪α干扰素荧光定量PCR方法，对Η(-15 细胞上稳定表达的猪α干扰素mRNA水平进行检测，具体操作步骤对猪α干扰素表达产物进行总RNA提取，用下游引物进行反转录，反转录(RT)反应体系如下总RNA 11 μΙ,ΙΟπΜ dNTPs 2μ1，下游引物1 μ1，65 温浴5min，然后置于冰上急冷，加5XM-MLV RT Buffer 4 μ ,M-MLV 1 μ ，Rnase Inhibitor (40υ/μ1) 1 μ ，总体积共 20 μ ，将上述混合物混勻后， 420C 60min ；70°C lOmin，进行反转录，反应结束后可以立即进行PCR反应或_20°C保存备用。按常规PCR扩增体系进行，反应程序为94°C预变性5min，PCR循环为94°C变性45s， 56. 2°C ( β-actin :55. 2)退火 40s, 72°C 延伸 40s，34 个循环后，72°C延伸 IOmin0 程序运行结束后，取6μ1 PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。同时real-time PCR 反应程序为95°C 30s，PCR 循环 95°C 10s, 60°C 34s，40 个循环。1.9.2 ELISA检测猪干扰素α表达 1.9. 2. 1试剂的准备
(1)收集重组质粒pcDNA3.0-poIFN α转染Η(-15细胞的上清液，IOOOrpm离心lOmin， 去除细胞残渣
(2)标准品的准备标准品稀释前将标准品振荡混勻，稀释比例按表1进行
表1猪α干扰素ELISA试剂盒标准品的稀释
1600pg/ml6号标准品原倍浓度不用稀释直接加入50ul800pg/ml5号标准品IOOul的原倍标准品加入IOOul的标准品稀释液400pg/ml4号标准品IOOul的5号标准品加入IOOul的标准品稀释液200pg/ml3号标准品IOOul的4号标准品加入IOOul的标准品稀释液100pg/ml2号标准品IOOul的3号标准品加入IOOul的标准品稀释液50pg/ml1号标准品IOOul的2号标准品加入IOOul的标准品稀释液Opg/ml空白对照原始浓度不用稀释直接加入50ul
(3)洗涤缓冲液用灭菌蒸馏水50倍稀释 1. 9. 2. 2操作步骤
(1)使用前，将所有试剂充分混勻，不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。 (2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，每个标准品和空白孔建议做复孔，每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔，标本用标本稀释液1 1稀释后加入50ul于反应孔内。(3)加入稀释好的标准品50ul于反应孔中，加入待测样品50ul于反应孔内，立即加入50ul生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混勻，37°C温育lh。(4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次。(5)每孔加入60ul的亲和链霉素-HRP，轻轻振荡混勻，37°C温育30min。(6)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次。(7)每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混勻，37°C温育lOmin，避免光照。(8)取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。(9)在450nm波长处测定各孔的OD值。2结果与分析
2.1猪α干扰素基因的PCR扩增
从分离的猪外周血白细胞中提取猪α干扰素基因总RNA，通过RT-PCR方法扩出一条 660bp大小的目的片段，与预期片段一致(如图1)，猪α干扰素的完整开放阅读框为570bp， 编码166个成熟氨基酸。2. 2重组质粒的鉴定
将纯化回收的DNA片段连接到pTG19-T载体后，转化和筛选白斑提取质粒，经PCR鉴定，获得阳性pTG19-T-poIFN-a重组质粒，用BamH
I单酶切，得到了与预期目标相符大小的片段，结果表明，目的DNA片段连接、转化正确(如图2)。2.3目的基因的序列测定
将鉴定为阳性的重组质粒送往大连宝生物工程公司测序，获得猪α干扰素的完整开放阅读框，通过Blast和DNAstar软件分析，并与GenBank上下载序列AY776246、 M28623, X57191和NM214393进行比对，核苷酸同源性都在95%以上，其中与序列AY435969 和匪214393的同源性达到为97. 4%，运用ClustralX 1. 81和MEG4软件绘制猪α干扰素系统发育进化树(如图3)，确定猪α干扰素测序结果正确， 2.4真核表达重组质粒的鉴定
利用真核表达引物Ρ3和Ρ4扩增出目的片段，并克隆到pcDNA3. O真核表达载体中，经 EcoR I和B10I双酶切鉴定，酶切片段大小与预期结果一致，送上海博尚测序分析，结果表明目的基因插入的位置、大小均正确。PCR扩增及酶切鉴定结果(如图4)。2. 5猪α干扰素转染ΡΚ-15细胞mRNA的提取
将重组质粒pcDNA-poIFN- α转染ΡΚ-15细胞后进行扩大培养，收集细胞，放入离心管中3000rmp离心lOmin，弃上清，用PBS液悬浮细胞，按照实验一的方法提取总RNA，结果出现与预期一致的目的片段。2. 6猪α干扰素ELISA试剂盒检测
以标准品浓度为横坐标，所测的OD值为纵坐标，绘制猪α干扰素标准曲线，以标准值为横坐标，所测的OD值为纵坐标，绘制标准曲线(图5)，根据公式y=0. 0016x+0. 1937，R2=0. 9895，换算出pcDNA-poIFN-α转染H(-15细胞的表达蛋白量标准值为883. 94pg/ml。2. 7猪α干扰素mRNA水平的检测
绘制溶解曲线，表明扩增产物形成单一的特异性溶解峰，溶解温度介于85°C 90°C之间。以β-actin为内参基因，应用相对荧光定量PCR检测猪α干扰素在冊_15细胞上的表达量，结果与PCDNA3.0空载体对照组相比，猪α干扰素mRNA转录水平明显上调(如图6)。2.8猪α干扰素稳定表达的冊_15细胞系的建立
真核表达质粒pcDNA-IFN-a转染H(-15细胞24h后，用500 μ g/mL G418进行筛选培养，6孔板长满后，转入细胞培养瓶中进行扩大培养，收集转染后的H(-15细胞，提取 PoIFNa的mRNA，经过PCR检测获得预期的目的片段；应用猪α干扰素ELISA试剂盒对猪α干扰素的表达蛋白进行检测，绘制标准曲线，获得猪α干扰素表达蛋白的表达量为 883. 94pg/ml ；通过建立猪α干扰素荧光定量方法，检测猪α干扰素mRNA的转录水平，结果与空载体的对照组相比，猪α干扰素mRNA转录水平明显上调；建立了猪α干扰素稳定表达的H(-15细胞系(图7)。
权利要求
1.带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，其特征在于所述猪干扰素α 基因具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，其特征在于所述猪干扰素α基因的扩增引物具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系的制备方法， 其特征在于它的步骤如下(1)利用反转录PCR方法从猪外周血白细胞中扩增猪干扰素α基因；(2)猪干扰素α基因插入真核表达载体的多克隆位点上，得到重组表达载体pcDNA-poIFNa ；(3)将重组真核表达载体pcDNA-poIFNa转染并筛选出稳定表达猪干扰素α基因的细胞系。
全文摘要
本发明公开了带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系及其制备方法，建立一种完整猪α干扰素基因的克隆、重组真核表达载体的构建以及稳定表达猪α干扰素的真核细胞系，将克隆的猪α干扰素cDNA基因插入到pcDNA3.0载体中构建真核表达载体pcDNA-poIFNα，通过脂质体转染猪PK15细胞，经G418筛选后用荧光定量PCR和ELISA方法分别检测猪α干扰素mRNA及蛋白的表达水平，构建了稳定表达猪α干扰素的PK15细胞系。采用一系列方法对获得的细胞在基因水平、转录水平和翻译表达水平进行鉴定。
文档编号C12N15/21GK102533662SQ20121000574
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者卢晓艳, 夏平安, 崔保安, 慕春龙 申请人:河南农业大学