专利名称：一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，属于生物学领域中分子生物学的检测方法。
背景技术：
盐分是限制植物生长和产量的主要环境因素之一，土壤盐渍化是一个世界性问题。植物耐盐新品种的选育，一直是国内外研究的重点。绒毛白蜡(Fraxinus Velutina Torr.)为木犀科(Oleaceae)白蜡属(Fraxinus Linn.)落叶乔木，原产为美国，生长快，树干通直，纹理美观，抗逆，是盐碱地造林、园林绿化和珍贵的用材树种，是唯一的盐碱地造林的大乔木树种。但是，大多数绒毛白蜡不能够在含盐量超过0.3%以上的盐碱地上正常生长和繁殖，其中山东省林业科学研究院刘德玺选育的鲁蜡3号(Fraxinus Velutina Torr. Lula 3)品种，具有非常强的耐盐能力，能够在含盐量0.5-0.6%条件下可以正常生长发育。该品种对沿海城市的绿化和美化、位于盐碱地的油田地区的绿化、盐碱地的土壤改良具有重要作用。
但从形态学鉴定耐盐和盐敏感植株非常困难，尤其是从耐盐和盐敏感植株杂交后代筛选出耐盐个体，通常要进行生理测定和耐盐试验，耗时、费力且许多表型特征的不稳定性，而且可能破坏植株，另外形态特征测量和生理指标测定结果时常出现误差。植物的耐盐性状是受多基因控制的，耐盐植株和盐敏感植株在基因组上存在一定的差异性。以PCR 为基础的分子生物学技术是快速检测生物基因组差异的重要方法之一，直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境因素的影响，且取材少， 在苗期可以进行选择，从而大大提高育种效率。然而，经检索目前国内外尚无对绒毛白蜡植物耐盐性状分子快速检测的相关报道。发明内容
本发明的目的是对已有耐盐品种杂交后代耐盐鉴定方法中存在的费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有快速、简便、成本低、灵敏度高的鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法。
本发明所述的快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，步骤是
(1)应用SEQ ID NO. 1所示核酸序列为SCAR标记，以绒毛白蜡植物DNA为模板， 利用所述SCAR标记的两条引物在M 56°C的退火温度下，进行PCR扩增，其中所述SCAR 标记的两条引物分别是
引物 1 :5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；
引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，；
(2)将上述PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上分离，观测PCR结果；
(3)鉴定是否为耐盐绒毛白蜡植株；如果PCR结果扩增出一条592bp的DNA条带， 判定为耐盐植株；如果PCR结果扩增不出592bp的DNA条带，判定为盐敏感植株。3
其中
步骤(1)所述的PCR反应总体积优选为25微升，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物 1(10μπιο1/υ μ 1，引物2(10μπιο1/υ μ l，20ng 基因组 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
步骤(1)所述的PCR反应参数优选为94°C预变性％iin，94°C变性30s，55°C退火 45s, 720C 1.5min，循环 30 次，72°C延伸 IOmin0
本发明采用RAPD技术，寻找与耐盐碱性状相关联的RAPD分子标记，进一步转化为稳定性、重复性强的SCAR标记，该SCAR标记是全长592bp的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。应用所述SCAR标记，以绒毛白蜡植物DNA为模板，采用简单易操作的 PCR扩增，即可利用分子标记快速检测绒毛白蜡杂交后代的耐盐植株与盐敏感植株，为利用分子标记辅助选育和基因工程等手段改良绒毛白蜡耐盐新品种提供了基础，加速了绒毛白蜡耐盐育种进程。为我国耐盐碱林木种质的选育研究提供理论基础和技术体系；丰富耐盐碱绿化树种的遗传多样性，扼制土地盐渍化，提高土地生产力；增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
本发明提供的快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，具有灵敏度高，所需DNA 用量少的特点，与常规形态学检测、耐盐试验、生理指标测定相比，本发明的有益效果是
1、简便易行在实验室采用常规PCR技术对绒毛白蜡植株进行检测，通过一次PCR 扩增就可以判断绒毛白蜡是否为耐盐单株或耐盐品种，在植株生长的任何时期都可以检测。
2、检测时间短该检测方法从取样到检测PCR扩增结果，大约6时间，常规的形态学检测、耐盐试验至少需要3-4个月的时间。
3、准确性高，重复性好以基因组DNA为材料，不易受外界因素的影响，以592bp的 PCR扩增条带为检测标准，减少人为判断误差，大大提高了检测的准确度。
4、缩短育种周期在绒毛白蜡的发芽期即可对其耐盐性进行早期检测，大大缩短了绒毛白蜡耐盐育种周期。
图1 :SCAR标记在Fl代绒毛白蜡单株中的PCR电泳谱带图。
其中M-DL2000Mark ；1-12-分别为耐盐绒毛白蜡；13_23 盐敏感绒毛白蜡。
具体实施方式
实施例1
1、挑选饱满无病虫害鲁蜡3号品种(山东省林业科学研究院刘德玺选育的绒毛白蜡耐盐新品种)F1代种子300粒，采自山东寿光试验站。分别放于1. 5ml离心管中，自来水冲洗干净后浸泡lOmin，用70%乙醇灭菌30秒，再用0. 1 %氯化汞灭菌8分钟，然后用无菌水洗涤5次，在无菌条件下接种到MS+5g/L琼脂+30g/L蔗糖的萌发培养基中(pH值 5. 8)，每瓶培养基中10粒种子，共30瓶，培养条件为昼温度25°C，夜温度18°C，光照强度 40 μ mol · m_2 · s—1，光照时间14h · cf1 (培养条件下同)，获得3叶1心种子苗。
其中MS 培养基组分为KN03 1900mg ·厂1，NH4NO3 1650mg ·厂1，MgSO4 · 7H20370mg · I/1，KH2PO4 170mg · I/1，CaCl2 · 2H20 440mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · ΙΛ ZnSO4 · 7H20 8. 6mg ·厂1，H3BO3 6. 2mg · Λ KI 0. 83mg ·厂1，NaMoO4 · 2H20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · Λ Na2-EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7H2027. 8mg · L—1，盐酸硫胺素 0. Img · L—1，盐酸比哆醇 0. 5mg · L-1，烟酸 0. 5mg · L-1， 肌醇 IOOmg · L—1，甘氨酸 2. Omg · L-1。
2、挑选生长一致的3叶1心种子苗连同根一起转接MS+5g/L琼脂+30g/L蔗糖 +200mMNaCl养基中(pH值5. 8)，每瓶培养基中6株种子苗，共30瓶，培养40d (培养条件同上)。筛选12株叶片全绿、生长良好的为耐盐株系，11株发育迟缓、叶片发黄为盐敏感植株， 用CTAB法提取叶片基因组DNA。
CTAB提取方法为
1)取0. 05 0. Ig绒毛白蜡叶片，于液氮中研磨。加入800 μ 1 DNA提取缓冲液 含有 2 % (w/v)CTAB,20mmo 1 /LEDTA(pH = 8· 0)、100mmol/LTris-HCl (pH = 8.0)、1.4mol/ LNaCl和2% β -巯基乙醇，轻轻颠倒混勻；
2)于65°C水浴中温育30min，每IOmin颠倒轻轻混勻，12000rpm，离心IOmin ；3)取上清700 μ 1，加入等体积氯仿/异戊醇04 1，V V)，轻轻颠倒混勻，4°C，12000rpm,离心 IOmin ；
4)取上清600 μ 1，加入等体积氯仿/异戊醇04 1，ν ν)，轻轻颠倒混勻，4°C， 12000rpm，离心 IOmin ；
5)取上清500 μ 1，加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，颠倒混勻，_20°C静置30min ； 6) 40C，12000rpm,离心 IOmin ；
7)去上清，用预冷的75%乙醇洗涤沉淀2次，4°C，lOOOOrpm，离心5min ；
8)在超净工作台干燥沉淀30min，力卩30 μ 1的灭菌ddH20溶解沉淀，待浓度和纯度检测后，置_20°C或_70°C冰箱保存备用。
3、以上述基因组DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物(引物1 5'TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)进行 PCR 扩增，反应总体积为25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ 1，20ng 基因组 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
4、在55°C的退火温度下，进行PCR扩增，反应参数为94°C预变性％iin，94°C变性 30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循环30次，72°C延伸IOmin0 PCR扩增产物在1. 0 %琼月旨糖凝胶电泳上分离，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。电泳Marker DL2000和试剂为TAKARA公司。
5、利用该SCAR标记对绒毛白蜡耐盐品种鲁蜡3号Fl代植株进行了 PCR检测，结果发现(见图1)，12株耐盐植株中，10株扩增出一条592bp的DNA条带，说明能扩增出DNA 条带的材料为耐盐材料；11株盐敏感植株都没有扩增出592bp的DNA条带，说明该材料为盐敏感材料。
实施例2
1、挑选饱满无病虫害鲁蜡3号(山东省林业科学研究院刘德玺选育的绒毛白蜡耐盐新品种)F1代种子400粒，采自山东寿光试验站。浸泡于温度为45°C的水中，每天换水 1次，4周种子露白后播种在草炭、珍珠岩、蛙石(体积比1 1 1)基质中，温度为25 530°C，相对湿度50 70%的温室中，待幼苗长到4片真叶时，将幼苗根部的草炭、珍珠岩和蛙石清洗干净，然后移栽到盛有1/2浓度的Hoagland营养液。每个塑料容器10株，25个塑料容器共移栽250株，并每隔两天将蒸发掉的水分用无离子水补充到原体积。
其中Hoagland’ s (霍格兰氏)营养液配方为硝酸钙945mg · Γ1 ；硝酸钾 607mg .L—1 ；磷酸铵 115mg .L—1 ；硫酸镁 493mg-r1 ；铁盐溶液 2. 5ml .L—1 ；微量元素 5ml .L—1 ； PH = 6. 0。铁盐溶液七水硫酸亚铁2. 78g ；乙二胺四乙酸二钠(EDTA. Na) 3. 73g ；蒸馏水 500ml ；pH = 5. 5。微量元素液碘化钾 0. 83mg · L-1 ；硼酸 6. 2mg · L-1 ；硫酸锰 22. 3mg · L-1 ； 硫酸锌 8. 6mg · L-1 ；钼酸钠 0. 25mg · L-1 ；硫酸铜 0. 025mg · L-1 ；氯化钴 0. 025 · L-1。
2、挑选生长一致的，15个塑料容器的植株，共150株，一周后开始加盐。每天按 50mM NaCI增加盐浓度，直至终盐浓度达到150mM NaCI。培养于温度25_30°C，相对湿度 50-70%的温室20d，筛选10株叶片全绿、生长良好的为耐盐株系，10株发育迟缓、叶片发黄为盐敏感植株，用CTAB法提取叶片基因组DNA。
3、以上述基因组DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物(引物1 5'TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)进行 PCR 扩增，反应总体积为25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ 1，20ng 基因组 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
4、在55°C的退火温度下，进行PCR扩增，反应参数为94°C预变性％iin，94°C变性 30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循环30次，72°C延伸IOmin0 PCR扩增产物在1. 0 %琼月旨糖凝胶电泳上分离，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。电泳Marker DL2000和试剂为TAKARA公司。
5、利用该SCAR标记对绒毛白蜡耐盐品种鲁蜡3号Fl代植株进行了 PCR检测，结果发现，10株耐盐植株中，10株都扩增出一条592bp的DNA条带，说明能扩增出DNA条带的材料为耐盐材料；10株盐敏感植株都没有扩增出592bp的DNA条带，说明该材料为盐敏感材料。
本发明所建立的检测方法能准确、快速的鉴定出耐盐绒毛白蜡品种，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测绒毛白蜡抗性的技术。
权利要求
1.一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，步骤是(1)应用SEQID NO. 1所示核酸序列为SCAR标记，以绒毛白蜡植物DNA为模板，利用所述SCAR标记的两条引物在M 56°C的退火温度下，进行PCR扩增，其中所述SCAR标记的两条引物分别是引物 1 :5’ TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，；(2)将上述PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上分离，观测PCR结果；(3)鉴定是否为耐盐绒毛白蜡植株；如果PCR结果扩增出一条592bp的DNA条带，判定为耐盐植株；如果PCR结果扩增不出592bp的DNA条带，判定为盐敏感植株。
2.根据权利要求1所述快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，其特征在于步骤 (1)所述的 PCR 反应总体积为 25 微升，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，引物 1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ l，20ng 基因组 DNA 2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
3.根据权利要求1所述快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，其特征在于步骤(1) 所述的PCR反应参数为94°C预变性％iin，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循环 30 次，72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，是应用SEQ ID NO.1所示核酸序列为SCAR标记，以绒毛白蜡植物DNA为模板，利用所述SCAR标记的两条引物在54～56℃的退火温度下，进行PCR扩增，扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观测PCR结果，进行是否是耐盐绒毛白蜡植株的鉴定；如果扩增出一条592bp的DNA条带为耐盐植株；如果扩增不出592bp的DNA条带为盐敏感植株。本发明可对绒毛白蜡植株在任何时期进行耐盐性检测且不影响其正常生长；可对绒毛白蜡植物分别归于耐盐和盐敏感材料进行快速分子检测和判别；检测迅速，费用低。
文档编号C12Q1/68GK102517398SQ20121000628
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者刘翠兰, 夏阳, 李双云, 束靖, 燕丽萍 申请人:山东省林业科学研究院