专利名称：一株用于防治棉花黄萎病的芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物农药技术领域，涉及一株用于防治棉花黄萎病的芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
由大丽轮枝菌(Verficillium dahliae)引起的黄萎病是棉花的主要病害，对棉花产量和品质均造成极大影响。对于棉花黄萎病的防治，国内外在抗病育种、农业措施和化学防治等方面均做了大量工作，棉花黄萎病为土传维管束病害，防治困难，难以找到很好的抗源种质资源，因而多年来一直未能培育出高抗黄萎病的棉花新品种，研究开发的病害防治方法和药剂亦难以达到理想的防治效果。目前生物防治被认为是最具有发展潜力的有效防治方法之一。大量的研究事实证明了生防菌处理植物后能达到促进生长与病害防治的目的。筛选大丽轮枝菌的拮抗细菌用于生物防治，或从拮抗菌中分离抗菌蛋白，克隆抗病基因，是获得抗病植株的有效手段，而获得高拮抗活性的菌株是生物防治的基础。我国在这方面的研究主要在小麦、棉花等作物病害防治上。目前，随着人们对无公害食品的要求和环境保护意识的日益增强，人们逐渐摆脱了防治病害完全依赖化学农药的观点，逐渐把生物防治与病害的综合治理联系起来，并成为其中重要组成部分。植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的细菌。被内生细菌感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过严格表面消毒的植物组织中分离。内生细菌主要分布于细胞间与维管束组织，广泛存在于植物的果实、种子、胚、根、茎、叶中。内生细菌具有能促进植物生长，增强宿主植物抗病性的特性， 且因定殖在植物体内，能躲避外界环境和和农药的伤害，与根际细菌相比有更多优势。在植物病害生防细菌中，芽孢杆菌是最易从土壤和植株中分离得到，并表现出较好防病作用的一类重要细菌。它是一类嗜温好氧或兼性厌氧、能产生耐热抗逆内生孢子的杆状细菌。由于这类细菌产生的芽孢对高热、强酸、紫外线、电磁辐射和一些化学药品有着很强的耐受力，其胞外分泌液中含有蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶类及其他活性代谢产物，因此，这类细菌以芽孢形态广泛存在于各种自然环境中，可以在一些恶劣的环境中生存，且能分解利用环境中一些其它微生物难以分解的矿物质。在农业生产中，芽孢杆菌在防病的稳定性、与化学农药的相容性等方面表现出其他种属细菌所没有的优势，加之易于制成粉剂， 便于储藏运输，利于实现大规模生产，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株用于防治棉花黄萎病的芽孢杆菌。本发明的另一目的是提供该芽孢杆菌41B-1的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现枯草芽孢杆菌(Baclillus subtilis) 41B-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委
3员会普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏号CGMCC No. 5582。菌株41B-1分离于陆地棉抗病品系选系R104的根系内部。经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析，该菌株与枯草芽孢杆菌 (Bacillus subfilis sfrain 2Re5)的同源性达到99. 0%，鉴定为枯草芽孢杆菌株。该菌株形态特征如下革兰氏染色阳性，鞭毛多根，长X宽为(0.65-1.0) μ mX (3.0-4. 5) μ m, 41B-菌落圆型，芽孢使孢囊膨大，形状隆起，不光滑，中间褶皱，边缘成波浪状，有菌膜(图 1)。淀粉水解、需氧性试验、硝酸还原试验、过氧化氢酶反应、V-P试验、利用糖类(D—葡萄糖、L 一阿拉伯搪、D —木糖、D —甘露醇等)产酸和产气试验均为阳性，卵磷脂试验、吲哚阴性，10% Nacl生长、pH 5. 7能生长，最适pH为7. 0，最适培养温度为37°C，最佳培养基成分为蛋白胨10g，酵母提取物5g, Nacl 10g，蒸馏水1000ml, pH 7. 0。所述的保藏号为CGMCC No. 5582的枯草芽孢杆菌41B-1在防治棉花黄萎病中的应用。有益效果本发明所述枯草芽孢杆菌菌株41B-1 (CGMCC No. 5582)能强烈抑制棉花强致病性黄萎病菌Hn-3菌丝的生长。该菌株代谢液产物对黄萎病菌Hn-3的孢子和菌株生长有强的抑制作用，10倍稀释的发酵液对黄萎病菌Hn-3菌丝生长的抑制率为97.6%，发酵液与黄萎病菌Hn-3孢子液等体积培养Mh，孢子基本不萌发。抗菌物质具有有水溶性、热稳定性、酸沉淀、及醇溶性等特点，初步鉴定为脂肽类抗生素。盆栽实验验证，41B-1(CGMCC No. 5582) 菌株能促进棉花感病品种苏棉9号出苗，对苏棉9号，41B-1防治黄萎病Hn-3的效应为 60.9%。通过微生物发酵可获得大量枯草芽孢杆菌菌株41B-1 (CGMCC No. 5582)菌株及抑菌有活性代谢物质。芽孢杆菌对人畜无毒，对农作物无毒害，绿色环保，且防治棉花黄萎病效果显著，具有良好的生物农药开发前景。
图1，41B_1的单菌显微照片及划线形态；A :41B-1的单菌显微照片，B :41B_1菌落划线形态。图2，41B_1对黄萎病菌的抑制作用。图3，41B_1的无菌发酵液对黄萎病菌菌丝生长的影响。图4，41B_1的无菌发酵液对黄萎病菌孢子萌发的影响。图5，41B_1发酵液中表面活性素的提取及对黄萎病菌的抑制作用。其中，1为氯仿甲醇(65 1)抽提物(即脂肽类抗生素)，2为发酵液上清，3为甲醇4为未经处理的发酵液。图6，41B_1对苏棉9号出苗率的影响。图7，41B_1对苏棉9号防治黄萎病的效果。生物材料样品保藏信息枯草芽孢杆菌(Baclillus subtilis) 41B-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期:2011年12月13日，保藏号=CGMCC No. 5582。
具体实施例方式实施例11. 1细菌的分离取生长健康的现蕾期的棉花抗病品系R104的主根，用灭菌过的刀片取主根5 IOcm处，浸入70%酒精lmin，以1. 05%次氯酸钠对样品表面灭菌，灭菌时间为15 18min， 取经检验表面灭菌彻底的材料1. OOg于无菌研钵中，加灭菌的PBS缓冲液研磨，静置15min 后加缓冲液定容至10ml，取上面制备的Iml分离液在摇床上剧烈振荡30min后于80°C的水浴中，保持15 20min。然后用无菌水进行梯度稀释后涂布LB平板，于37°C培养箱内培养 48h左右，挑取菌落形态差异明显的单菌落，纯化后接斜面保存进入初筛程序。1. 2平板扩散法筛选拮抗细菌1. 2. 1. 1菌株的制备将1. 1中分离的所有菌株，在LB平板上活化，挑取一环接种于含細1 LB培养液的试管中，28°C下170r/min振荡培养Mh。1. 2. 2. 2棉花黄萎病菌孢子悬浮液的制备取在P DA平板上活化的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb) Hn_3 (下文称棉花黄萎病菌Hn-3)菌丝块，接种于察贝克液体培养基中，28°C下120r/min恒温摇床振荡培养6天。用灭菌纱布滤去培养液中的菌丝，用无菌水将孢子浓度调为IX IO7Hir1备用。吸取制备好的棉花黄萎病菌Hn-3孢子悬浮液anl，加入到熔化并冷却到45°C左右的100ml PDA培养基中，混勻，倾覆在已凝固的PDA平板上，待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔(直径为6mm)，在每个孔内加各供试菌株培养液30 μ 1，以LB培养液作为空白对照，每处理设3个重复，将平板置于恒温培养箱内培养3 后观察是否可产生抑菌圈 (图幻，选择抑菌直径大，效果稳定的株菌，命名为41B-1。该菌株形态特征如下革兰氏染色阳性，鞭毛多根，长X宽为(0. 65-1. 0) μ mX (3. 0-4. 5) μ m。41B-1菌落圆型，芽孢使孢囊膨大，形状隆起，不光滑，中间褶皱，边缘成波浪状，有菌膜(图1)。淀粉水解、需氧性试验、 硝酸还原试验、过氧化氢酶反应、V-P试验、利用糖类(D —葡萄糖、L 一阿拉伯搪、D —木糖、 D 一甘露醇等)产酸和产气试验均为阳性，卵磷脂试验、吲哚阴性，10% Nacl生长、pH 5. 7 能生长。最适PH为7.0，最适培养温度为37°C。最佳培养基成分为蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。经16S rDNA序列分析，菌株41B-1与枯草芽孢杆菌(Bacillus subfilis sfrain 2Re5)的同源性达到99. 0%，鉴定为枯草芽孢杆菌株。将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2011年12月 13 日，保藏号CGMCC No. 5582。实施例2草芽孢杆菌41B-1 (CGMCC No. 5582)拮抗机理研究2. 1枯草芽孢杆菌发酵液的制备用牙签提取41B_1(CGMCC No. 5582)单菌落到液体LB培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，蒸馏水1000ml,pH 7. 0)，37°C，12h，后按1 %接种量接种到新鲜LB培养基，震荡培养48h，将上述枯草芽孢杆菌菌液，经离心(lOOOOr/min，20min)后，取上清用0. 22 μ m的滤膜过滤得到该菌的无菌发酵液，密封后置于冰箱内待用。2. 241B-1 (CGMCC No. 5582)发酵液对黄萎病菌Hn_3菌丝生长的抑制作用取2. 1中制备的41B-1 (CGMCC No. 5582)无菌发酵液，按不同比例与冷却45°C左右的PDA培养基均勻混合，凝固后在平板中央接种黄萎病菌Hn-3菌块，对照加LB。每处理 3个重复，28°C培养7天，测菌块菌落直径，计算抑菌率，无菌水作对照，结果表明10倍稀释的发酵液对黄萎病菌Hn-3菌丝生长的抑制率为97. 6%，200倍稀释后抑制直径仍能达到 37. 3% (表 1，图 3)。表1.代谢液不同稀释比例的拮抗效果
_CK_0.5:100_1:100_2:100直径(cm)L85ΓΤ 075065
抑制率 ％_0_3Λ3_59,5_64.92. 341Β-1 (CGMCC No. 5582)发酵液对黄萎病孢子萌发抑制作用制备黄萎病菌Hn-3孢子悬液(方法同1. 2. 2. 2)，取等体积孢子悬液与 41B-1 (CGMCC No. 5582)无菌发酵液，震荡培养7d，LB作对照，检测孢子的萌发情况，结果表明培养24h后处理孢子基本不萌发，图4。实施例3发酵液中拮抗物质初步性状的测定3. 1热稳定性取2. 1 中制备的 41B_1(CGMCC No. 5582)无菌发酵液，分别经 40°C，60°C，80°C， 100°C水浴30min，，以未经水浴处理的发酵液为对照，采用平板扩散法检测其对棉花黄萎病菌Hn-3的抑菌活性，结果表明拮抗物质具有强的热稳定性(表2)。表2.不同温度对拮抗物质抑菌活性的影响
温度rc)CK406080100抑菌直径(cm)01. 51. 21.丄1. 03. 2对pH的稳定性取2. 1中制备的41B-1 (CGMCC No. 5582)无菌发酵液，将其pH值分别调为5. 0， 7. 0，10. 0和12. 0。以未经处理的41B-1 (CGMCC No. 5582)无菌发酵液为对照，采用平板扩散法检测其对棉花黄萎病菌Hn-3的抑菌活性，结果表明抑菌物质的最适pH范围为7-10，偏酸或偏碱拮抗性均有所减弱。当PH值为7. 0时，活性最大，抑菌直径为1. 70，高于未处理粗提液PH为8. 8抑菌直径为1.63。pH值小于3时，有沉淀析出(表3)。表3.不同pH下抑菌物质活性变化
pH 5. 07. 08. 8 (CK)10. 012. 0抑菌直径(cm) 1. 131. 701. 631. 631. 16实施例4发酵液中脂肽类抗生素的提取及抗性鉴定用牙签提取41B-1 (CGMCC No. 5582)单菌落到液体LB培养基，37°C，12h，按2%接种量接种到新鲜LB培养基，28°C震荡培养48h，12000，4°C，离心20分钟，取上清用5M HCl 调pH至2.0，然后轻微搅动池或过夜。离心，用有机物氯仿甲醇(65 1)抽提沉淀，抽提物旋转蒸发去除有机相，得到的即为41B-1 (CGMCC No. 5582)脂肽类抗生素，用PH8. 0的无菌水溶解过滤除菌后检查抑菌活性，以41B-1 (CGMCC No. 5582)无菌发酵液作为阳性对照，观察氯仿甲醇阳5 1)抽提物(即脂肽类抗生素)、发酵液上清、甲醇、未经处理的发酵液对黄萎病菌的抑菌效果。结果显示41B-1(CGMCC No. 5582)脂肽类抗生素对棉花黄萎 病菌有强的抑菌作用，与CK 一样，而HCl沉淀后所得的上清液没有抑菌活性(图5)。实施例MlB-I (CGMCC No. 5582)对棉花黄萎病菌的防治效果5.1种子出苗率的观察菌体悬浮液制备将41B-1 (CGMCC No. 5582)接种在液体LB中，37°C恒温培养Mh， 离心去上清，无菌水重悬，稀释成OD = O. 1的菌悬液。用41B-1 (CGMCC No. 5582)细菌悬浮液 浸泡表面灭菌的苏棉9号棉花种子Mh，然后播种于盛有灭菌营养土的营养盒中，每处理播 种50粒种子，每处理设3次重复。15天后调查棉苗数量，结果表明41B-1 (CGMCC No. 5582) 浸种后能提高棉花幼苗出苗率(表4，图6)，比对照高出18%。表4. 41B-1对苏棉9号出苗率的影响
权利要求
1.枯草芽孢杆菌(Baclillussubtilis)41B-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏号CGMCC No. 5582。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCCNo. 5582的枯草芽孢杆菌41B-1在防治棉花黄萎病中的应用。
全文摘要
本发明属于生物农药技术领域，涉及一株用于防治棉花黄萎病的芽孢杆菌及其应用。枯草芽孢杆菌(Baclillus subtilis)41B-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏号CGMCC No.5582。所述的保藏号为CGMCC No.5582的枯草芽孢杆菌41B-1在防治棉花黄萎病中的应用。枯草芽孢杆菌41B-1(CGMCC No.5582)对人畜无毒，对农作物无毒害，绿色环保，防治棉花黄萎病效果显著，具有良好的生物农药开发前景。
文档编号C12N1/20GK102443559SQ20121000616
公开日2012年5月9日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者唐灿明, 李顺鹏, 赵明文, 韩琴 申请人:南京农业大学