专利名称：未知粉末现场筛查试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对可能含有生物源恐怖物质的未知粉末样本的现场筛查试剂盒 及筛查方法，可用于筛查未知粉末样本是否含有生物源恐怖危害物质，如，病原微生物、生 物毒素及其类似物。
背景技术：
自炭疽芽孢“粉末邮件”事件以来，未知粉末在非战场如私人住宅、邮局、学校、购 物中心等屡有出现，但多例均为无害的物质例如糖粉末、面粉、纸纤维、干墙土、化妆品和鸡 精等。用先进的仪器设备来对大量普通无害的白色粉末进行逐个检测在人员、时间、实验室 资源上造成极大的浪费。目前用于现场的快速检测方法均基于免疫或核酸检测原理。可以用作生物源恐 怖危害性物质的微生物和蛋白毒素有多种，基于免疫或核酸检测的方法都只能有针对性地 检测是否含有某种特定物质。例如文献Nat. Rev. Microbiol. 2004, 2，721-726 (Rainey GJ, Young JA.)报道的基于抗体的横流试纸条，往往需要组合包装，不同的生物源恐怖危害性 物质，如炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、蓖麻毒素等等进行逐个筛查，无法快速简便地得到 准确结果。另外，通过免疫动物产生抗体的方法需要时间较长且过程繁琐，基于抗体的分析 方法很难保证在短时间内产生大量抗体，这样无法应对不可预期的生物袭击。美国疾病预防控制中心所列“A”名单上所有的生物源恐怖危害性物质，如炭疽芽 孢杆菌、天花病毒、肉毒毒素等均含蛋白。因此，若利用检测蛋白质的高灵敏度比色反应，对 蛋白进行特征性鉴别，便可排除不含蛋白质的普通无害样品，另外，糖在维持和发挥蛋白活 性，特别是在发挥蓖麻毒素等糖蛋白的生物功能方面有着重要意义，生物活性物质仅在生 理PH才能发挥最佳活性，而在极端pH下不能长期存活。微生物和生物毒素的这些与糖及 PH相关的特性可为未知粉末的来源提供辅助信息。我们即根据这些特性，设计出区分不含 与被怀疑含有生物源恐怖物质的未知白色粉末的现场筛查试剂盒，再把被怀疑含有生物源 恐怖物质的未知白色粉末提交相关实验室作进一步检测，无须实验室全面检测未知样品。 由于此方法对微生物和蛋白毒素检测的通用性，可对大量未知粉末进行快速前期筛查，方 便在短时间内大量生产，以应对恐怖分子的生物袭击。蛋白质检测、糖类物质检测以及pH指示项的检测/指示体系可以分别使用各种成 熟的检测体系或在其基础上加以改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、灵敏的未知粉末现场筛查试剂盒，用于筛查区分 不含有和可能含有生物源恐怖物质的未知粉末。为了实现上述目的，本发明由蛋白质检测项(A)、糖类物质检测项(B)及pH指示项 (C)组成。本发明的A、B、C三项的检测/指示溶液选用了特定的化学显色试液。
所述的A项的化学显色试液选用了 BCA蛋白检测体系。BCA蛋白检测体系包含BCA 检测试剂 1(1. 0% BCA, 2. 0% Na2CO3,0. 16%酒石酸钾钠，0. 4% NaOH, 0. 95% NaHCO3, pH 值 11. 2-11. 5)和BCA检测试剂II (4% CuSO4)，A瓶中含BCA检测试剂I 1 mL，取样棉签a则 预混和BCA检测试剂II。反应原理为蛋白质中含有的还原性氨基酸残基在碱性环境下可还 原Cu2+离子成为Cu+离子，继而Cu+离子与BCA产生敏感特异性结合，可生成肉眼可视的紫 色产物，从而特征性的鉴别蛋白质。高灵敏度比色法在蛋白质分析中有着大量实际应用，如 Bradford法、双缩脲法、Lowry法、邻苯三酚红法和BCA法等，此类方法都可用作该试剂盒的 A项。所述的糖类物质检测项的化学显色试液选用了浓硫酸-色氨酸体系。B瓶中含 77%浓硫酸0.5 mL，取样棉签b预饱和了 色氨酸溶液。可对糖类物质特征性鉴别的检 测体系都可用作为试剂盒的B项。 所述的PH指示项的化学显色试液选用了多种染料共同配制的通用型PH指示剂 (百里香酚蓝5mg，甲基红25mg，溴百里香酚蓝60mg，酚酞60mg。溶于75mL乙醇，加水定容 至100mL。纯水稀释50倍使用)。检测溶液瓶中装有稀释后的通用型指示剂lmL。除了此 类通用型指示剂，只要在酸和碱环境中可改变颜色的商品化PH指示试剂都可采用(如，石 蕊试剂)。本发明的A、B两项使用的取样棉签经分别经上述显色试液部分有效组成部分预 饱和，取样棉签c为空白棉签。棉签本身用惰性材料制成，不与检测体系中任何物质反应。 本发明的A项中，另使用一阳性对照棉签，其用BSA溶液预饱和，用于保证蛋白质检测溶 液的有效性。本发明遵循特定的检测流程，结合三项的检测/指示结果给出筛查判断。流程及 结果判断包括以下几个步骤(1)以取样棉签a蘸取足够量的待测未知粉末，浸入A瓶，搅拌使粉末和溶液充分 接触。等待5分钟，若样品中不含有蛋白质，则A瓶溶液颜色呈浅绿色；若样品中含有蛋白 质，则A瓶溶液颜色呈紫色；(2)若步骤1中A瓶溶液未在5分钟后呈现紫色(即蛋白质反应为阴性)，取阳性 对照棉签a2浸入A瓶，5分钟后观察显色。溶液颜色若呈现紫色，则表示步骤1检测结果正 确；若A瓶溶液未呈紫色，则认为A项已失效，(1)所测试结果无效；应另取A项对未知粉末 进行测试；(3)以取样棉签b蘸取足够量的待测未知粉末，浸入B瓶，搅拌使样品和溶液充分 接触。等待5分钟，若样品中不含有糖类物质，则B瓶溶液颜色呈浅黄色；若样品中含有糖 类物质，则溶液颜色呈红棕色；(4)以取样棉签c蘸取足够量的待测未知粉末，浸入C瓶，搅拌使样品和溶液充分 接触。红色溶液指示粉末呈酸性；黄色至绿色溶液指示粉末呈中性；深蓝色至蓝紫色溶液 指示粉末为碱性；(5)上述⑴(3) (4)项可同时操作。若A瓶溶液呈现紫色，即蛋白质反应阳性结 果；同时C项溶液呈现黄色至绿色，即pH中性结果，则粉末中可能含有生物源恐怖危害物 质，需使用其它方法进一步检测或确证。其余的结果均可判断粉末为不含生物源恐怖危害 物质。
下面结合附图对本发明作进一步说明，附图为试剂盒的全视图。1、2、3分别为A瓶(蛋白质检测项)、B瓶(糖类物质检测项)和C瓶(pH指示 项)；4为盛放溶液瓶和棉签的纸盒；5为纸盒上的小窗，方便观察瓶中溶液的显色反应；6、 7、8、9分别为A、B、C三项的取样棉签以及阳性对照棉签；10为棉签的密封包装袋。
具体实施方式
——例1现场检测糖粉末，其步骤如下(1)取样棉签a蘸取足够量的糖粉末，浸入A瓶，搅拌使样品和溶液充分接触。等 待5分钟，溶液颜色呈浅绿色，表示粉末中不含有蛋白质；(2)取阳性对照棉签a2浸入A瓶，5分钟后观察显色。溶液颜色变紫，表示步骤1 检测结果有效；(3)以取样棉签b蘸取足够量的糖粉末，浸入B瓶，搅拌使样品和溶液充分接触。 等待5分钟，溶液颜色变红棕色，表示粉末中含有糖类物质；(4)以取样棉签c蘸取足够量的糖粉末，浸入C瓶，搅拌使样品和溶液充分接触。 溶液呈绿色指示粉末呈中性；(1) (3)⑷项是同时操作的；结果表明，A项溶液不呈现紫色，即蛋白质反应阴性结果；判断粉末为普通无害物 质。
具体实施方式
——例2现场检测蓖麻毒素，其步骤如下(1)以取样棉签a蘸取足够量的蓖麻毒素粉末，浸入A瓶，搅拌使样品和溶液充分 接触。等待5分钟，溶液颜色呈紫色，表示粉末中含有蛋白质；(2)以取样棉签b蘸取足够量的蓖麻毒素粉末，浸入B瓶，搅拌使样品和溶液充分 接触。等待5分钟，溶液颜色呈浅黄色，表示粉末中不含有糖类物质；(3)以取样棉签c蘸取足够量的蓖麻毒素粉末，浸入C瓶，搅拌使样品和溶液充分 接触。溶液呈绿色指示粉末呈中性；(1)⑵(3)项是同时操作的；结果表明，A项溶液呈现紫色，即蛋白质反应阳性结果；同时C项溶液呈现黄色至 绿色，即pH中性结果，则粉末中可能含有生物源恐怖危害物质，需使用其它方法进一步检 测或确证。
权利要求
一种未知粉末现场筛查试剂盒，由蛋白质检测项(A)(包括试液瓶A、取样棉签a和阳性控制棉签a2)、糖类物质检测项(B)(包括试液瓶B和取样棉签b)及pH指示项(C)(包括试液瓶C和取样棉签c)组成，其特征在于三个检测/指示项选用特定的化学显色试液。
2.根据权利要求1所述的未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于A瓶的化学显色试液 选用了 BCA蛋白检测体系，在粉末样品中存在蛋白质的情况下，检测试液能发生可辨别的 颜色变化；A瓶的化学显色试液也可选用其他的能灵敏鉴别蛋白质的显色试剂。
3.根据权利要求1所述的未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于B瓶的化学显色试液 选用了 77%浓硫酸-1%色氨酸检测体系，在粉末样品中存在糖类物质的情况下，检测试液 能发生可辨别的颜色变化；B瓶的化学显色试液也可选用其他的能灵敏鉴别糖类物质的显 色试齐LU
4.根据权利要求1所述的未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于C瓶的化学显色试液 选用了通用型PH指示剂(百里香酚蓝5mg，甲基红25mg，溴百里香酚蓝60mg及酚酞60mg 溶于75mL乙醇，加水定容至IOOmL配制为储备液，使用时以蒸馏水稀释50倍)，能指示粉末 样品的PH范围；C瓶的化学显色试液也可选用能在酸和碱环境中改变颜色的商品化试剂或 其他通用型PH试剂。
5.一种未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于A、B、C三项使用的取样棉签经显色试 液有效组成部分预饱和。
6.根据权利要求5所述的未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于取样棉签A预饱和 了 BCA试剂II ；取样棉签b预饱和了 色氨酸溶液；取样棉签c为空白棉签。
7.一种未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于含有预饱和蛋白溶液的阳性控制棉签 a2以保证蛋白质检测项的有效性。
8.一种未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于所述试剂盒遵循特定的检测流程，结 合三项的检测/指示情况给出筛查结果判断，流程及相应结果判断包括以下几个步骤(1)以取样棉签a蘸取足够量的待测未知粉末，浸入A瓶，搅拌使粉末和溶液充分接触。 等待5分钟，若样品中不含有蛋白质，则A瓶溶液颜色呈浅绿色；若样品中含有蛋白质，则A 瓶溶液颜色呈紫色；(2)若步骤1中A瓶溶液未在5分钟后呈现紫色(即蛋白质反应为阴性)，取阳性对照 棉签a2浸入A瓶，5分钟后观察显色。溶液颜色若呈现紫色，则表示步骤1检测结果正确； 若A瓶溶液未呈紫色，则认为A项已失效，⑴所测试结果无效；应另取A项对未知粉末进 行测试；(3)以取样棉签b蘸取足够量的待测未知粉末，浸入B瓶，搅拌使样品和溶液充分接触。 等待5分钟，若样品中不含有糖类物质，则B瓶溶液颜色呈浅黄色；若样品中含有糖类物质， 则溶液颜色呈红棕色；(4)以取样棉签c蘸取足够量的待测未知粉末，浸入C瓶，搅拌使样品和溶液充分接触。 红色溶液指示粉末呈酸性；黄色至绿色溶液指示粉末呈中性；深蓝色至蓝紫色溶液指示粉 末为碱性；(5)上述(1)(3) (4)项可同时操作。若A瓶溶液呈现紫色，即蛋白质反应阳性结果；同 时C项溶液呈现黄色至绿色，即pH中性结果，则粉末中可能含有生物源恐怖危害物质，需使 用其它方法进一步检测或确证。其余的结果均可判断粉末为不含生物源恐怖危害物质。
9.一种未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于5分钟内即可完成整个检测流程；
10.一种未知粉末现场筛查试剂盒，其特征在于各检测/指示项的显色试液储存于无 色透明玻璃瓶中。
全文摘要
本发明提供了一种未知粉末的现场筛查试剂盒，由蛋白质检测项、糖类物质检测项及pH指示项组成。其特征在于所述的三个检测/指示项选用特定的化学显色试液；各项使用的取样棉签经显色试液有效组成部分预饱和；阳性对照棉签用于保证蛋白质检测溶液的有效性；所述试剂盒遵循特定的检测流程，结合三项的检测/指示结果给出筛查判断；所述试剂盒于5分钟内完成整个检测流程；各检测/指示溶液储存于无色透明玻璃瓶中。本发明的有效期不低于6个月。本发明的优点是操作简便，可快速区分出普通无害的和可能含有生物源恐怖危害性物质的粉末样品，适用于现场检测，对大量未知粉末进行快速前期筛查。
文档编号G01N33/52GK101881765SQ200910136550
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者冯建林, 刘希, 毛军文, 谢剑炜, 郭磊 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所