专利名称：耐盐碱绒毛白蜡scar标记及其在辅助选择育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SCAR标记及其应用，尤其涉及一种耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记及其在辅助选择育种中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
白蜡属全世界约70余种，大多数分布在北半球暖温带，中国已有34种，其中原产 26种，国外引进8种。续毛白腊(Fraxinus VelutinaTorr.)为木庫科(Oleaceae)白腊属 (Fraxinus Linn.)落叶乔木,原产为美国，生长快,树干通直,木质结构均勻，纹理美观,易繁殖、抗逆，是优良盐碱地造林、园林绿化和珍贵的用材树种。早在1911年引种到济南(孟昭和等，2001)，1953年被转引到天津(杨瑞兴等，1996)，80年代后在华北华东地区广泛栽培。目前已成为我国华北、华东主要沿海城市及盐碱地区造林和园林绿化优良树种(时明芝，1996 ;王勤等，2000 ;倪国祥等，1995 ;王友平等，2007)。国内关于白蜡生态特性、生长习性方面的研究较多，主要侧重于白蜡的耐盐碱性、 苗木繁育、造林技术等方面。樊宝敏(1992)报道，绒毛白蜡对呈碱性反应的滨海盐土较为敏感；孟康敏(1999)对5个滨海盐碱地引种的树种幼苗进行盆栽耐盐性试验，根据光合速率、叶绿素含量、细胞膜透性、丙二醛含量、游离脯氨酸含量等5个耐盐性生理指标进行综合评判，结果表明绒毛白蜡耐盐力最强；刘德玺等(2008)以盐溃生境下1-3年生红涔为材料，对不同树龄红涔的各营养器官中盐离子分布规律进行了研究；王友平等(2009)研究了盐溃生境下1-3年生绒毛白蜡不同营养器官中盐离子分布规律。近年来国外报导多集中在欧洲白腊(F. excelsior)的核DNA微卫星、叶绿体微卫星标记、EST-SST标记筛选分离，以及微卫星标记在种群遗传分析与系统发生生物地理学研究上。Heurtz等(2004)通过对全欧洲野生F. excelsior群体的叶绿体DNA与叶绿体微卫星分析认为,较低的单倍体多态是由于风媒植物的基因流影响。Bacles等(2008)利用微卫星标记进行了大尺度景观下苏格兰 F. excelsior群体的花粉基因流的父本分析，花粉基因流的交换取决于群体大小，而不是地理位置。Goto等(2006)利用5个微卫星位点对日本北部滨海森林的F. mandshurica var. japonica的亲本与后代的基因型分析，结果表明小范围内亲本的个体分析可以为风媒植物提供定量的分析。对绒毛白腊(F. Velutina)的相关DNA标记序列未能在GenBank上检索到，遗传学基础研究十分薄弱，遗传背景信息匮乏，这在很大程度上限制了选择育种工作的顺利开展。因此开展相应的遗传学基础研究、定位重要经济性状是我国白蜡选育工作中首先需要解决的问题。此外，传统的白蜡分类主要依靠果实形状和果翅数目的不同，该分类方法无法有效的在幼树早期进行应用。因此利用分子生物学办法、建立有效、快捷的种质鉴别方法对解决我国白蜡树良种选育具有重要的意义。分子标记辅助选择育种是一种新型的育种方式，应用分子标记辅助选择育种，可有效的检测基因型，进行QTL定位，直接通过标记基因辅助选择含有目标基因型的个体。与传统的育种方法相比，分子标记辅助选择育种方法，直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；中性标记，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁共显性标记，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。RFLP标记、AFLP标记操作较为繁琐，而RAPD标记准确性和稳定性较差，均不适合于大规模的田间材料的鉴定工作；SCAR标记操作简便、准确性高、稳定性高克服了上述标记的缺点，为首选的分子标记方法。由于林木育种周期长，要改变在绒毛白蜡育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路，缩短育种年限，加快分子标记辅助选择利用的研究。因此，获得耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记，对于绒毛白蜡良种选育具有重要的意义，为我国耐盐碱林木种质的选育研究提供理论基础和技术体系；丰富耐盐碱绿化树种的遗传多样性，扼制土地盐溃化，提高土地生产力；增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记及其在用于辅助选择育种中的应用。本发明所述的耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记，其特征在于，该SCAR标记是全长592bp 的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。为实现上述任务，本发明采取如下步骤的技术方案(I)、以2株高耐盐型绒毛白蜡分别为R36、R39和5株普通绒毛白蜡为材料；(2)、采用CTAB法提取绒毛白蜡叶片总DNA ；
(3)、建立并优化绒毛白蜡RAPD反应体系，获得稳定高效的RAPD扩增结果；(4)、应用RAPD 分析筛选出一个与耐盐碱相关联的分子标记S20-592 ； (5)、将耐盐碱基因的RAPD分子标记 S20-592克隆、测序并转化为SCAR标记。其中步骤(I)所述的高耐盐型绒毛白蜡R36、R39是山东省林业科学研究院刘德玺通过 20年的选育获得。步骤⑵所述的采用CTAB法提取绒毛白蜡叶片总DNA的具体方法是1)取0. I
0.2g绒毛白蜡叶片，于液氮中研磨。加入800 ill DNA提取缓冲液含有2% (w/v)CTAB, 20mmol/LEDTA(pH = 8. 0) UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% @ -巯基乙酉享，轻轻颠倒混勻；2)于65°C水浴中温育30min,每IOmin颠倒轻轻混勻，12000rpm,离心 IOmin ;3)取上清700 ii L,加入等体积氯仿/异戍醇(24 I, v v),轻轻颠倒混勻,4°C, 12000rpm,离心IOmin ;4)取上清600ii I,加入等体积氯仿/异戍醇(24 : I, v : v),轻轻颠倒混匀，4°C，12000rpm,离心IOmin ；5)取上清500 U 1，加入2倍体积的冰冷的无水乙醇， 颠倒混匀，-20°C静置30min ;6) 4°C，12000rpm，离心IOmin ；7)去上清，用预冷的75%乙醇洗漆沉淀2次，4°C, IOOOOrpm,离心5min ；8)在超净工作台干燥沉淀30min,加30 y I的灭菌蒸水(ddH20)溶解沉淀，待浓度和纯度检测后，置_20°C或_70°C冰箱保存备用。步骤(3)所述的RAPD扩增的具体方法是PCR反应总体积25 yl，IOX反应缓冲液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5 y 1，30ng/y I 引物 P 2 yl，模板 DNA 2u l，2u/ul TaqDNA 聚合酶 0. 25 ii 1，ddH20 14. 95 u I ;PCR 反应条件95 °C 预变性 5min， 94°C变性 30s, 36°C退火 lmin,72°C延伸 2min,循环 44 次,72°C延伸 IOmin0 电泳 Marker 和试剂为TAKARA公司生产，扩增后用I. 0%的琼脂糖凝胶电泳，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。
步骤(4)所述的具体方法是随机抽取5株普通绒毛白蜡和2株高耐盐碱植株 R36、R39，分别建立5株普通绒毛白蜡混合基因池和R36、R39高耐盐碱植株3个基因池，利用上海生物工程公司合成的S系列引物150个，对高耐盐碱和普通绒毛白蜡混合基因池进行了 RAPD分析，发现只有S20引物的扩增产物在高耐盐植株和普通植株中表现多态性。图 I是引物S20的RAPD扩增结果，在耐盐碱植株中能观察到一条分子量约为600bp的特异条带的分子标记S20-592，重复试验3次，此带仍能稳定出现。步骤(5)所述分子标记S20-592克隆、测序并转化为SCAR标记的具体方法是将 PCR扩增出的特异片断S20-592DNA经I. 0%琼脂糖凝胶电泳后，用博大泰克生产的玻璃奶试剂盒回收，操作按照试剂盒说明书进行。回收后的DNA片断与PMD-18T Vector连接，转化大肠杆菌DH5 a，重组质粒经T7、Sp6PCR电泳检测，获得阳性克隆子，送上海生物工程公司测序，其核酸序列全长592bp，具体为ggacccttaccaaatgacaatcaatttctatgtgcttggtttgttcgtggaaaactggat60
tacttgctatgcctatagcaaatgactattacagaacaacaaagcaggtctggtgtgatc120
aatttgcaagttattcaatatagtttttggccatgtaaactcacggacggctgcagccat180
tgatctgtattcagcttcagctgaagatcttgatacagtgtgttgcttcttggacttcca240
tgacacaagggaattgcccaaaaagatacaatatcctgtaatcgactgtcttgtatccga300
acatgctgcccgatcagcatCBCBBCBBCCtttgagcagaagatcagatttgctagaaat360
gaataaccctgtcttgatgagttctacagataccttaggcgtgataagctgcctccagat420
gagactgtcttggggactgaaggaattgactcagaacttgtacaggattaaataaatctg480
gcctggtaatagttaggtacaaaatcctcccaacaagccttttgtaggcattaagatcat540
ctacaggctcttcttcatcctttctcaactttaggttgcacggtaagggtCC592
将测序结果用生物信息学SMS进行分析，并通过Internet与GenBank国际基因数
据库进行同源性分析，没有查询到相关的基因序列与该片断同源，说明该片断是与耐盐碱续毛白腊相关联的新的分子标记。根据克隆片断的DNA序列，合成了 SCAR标记特异引物(上海生物工程公司合成)， 其序列为正向引物FS20-592:5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，反向引物RS20-592:5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’用上述引物在高耐盐碱R36、R39和普通绒毛白蜡的5个单株中分别进行扩增，PCR反应体系总体积为25iU，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 (天根生化科技有限公司),FS20-592 (10 u mol/L) lul, Rs20-592 (10 u mol/L) I u I,模板 DNA (20ng) 2 y I， ddH208. 5 ill ;扩增反应条件为94 °C预变性4min，94 V变性30s，55 °C退火45s， 72°C I. 5min，循环 30 次，72°C延伸 lOmin。电泳 Marker 为 TAKARA 公司生产的 DL2000，扩增后用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察拍照。扩增结果表明，在高耐盐碱绒毛白蜡中扩增出592bp特异条带，而在普通绒毛白蜡单株中未扩增出特异条带，如图2所
/Jn o为了验证SCAR标记的可靠性，对R36高耐盐植株Fl代分离群体抗盐性进行了分析。结果表明在抗盐植株个体中检测到了 SCAR标记，而在感性植株中未检测到SCAR标记。本发明所述耐盐碱绒毛白蜡的SCAR标记在用于辅助选择育种中的应用。
本发明采用RAPD技术，寻找与耐盐碱性状相关联的RAPD分子标记，进一步转化为稳定性、重复性强的SCAR标记，为开展耐盐碱绒毛白蜡分子标记辅助育种奠定了基础，为缩短育种周期提供了技术保障。本发明获得了续毛白腊耐盐喊相关基因的一个稳定SCAR标记，提不该续毛白腊耐盐碱SCAR标记在辅助选育绒毛白腊耐盐碱新品系中具有广泛应用。本发明的有益效果本发明是利用分子标记方法得到一个新的与绒毛白蜡抗盐碱基因相关联的RAPD分子标记，并通过克隆、测序、引物设计，又将RAPD标记转换成稳定的 SCAR标记，为绒毛白蜡分子标记辅助选择育种体系奠定了基础，与目前技术相比，其优点是1)本标记为稳定的SCAR标记，可广泛用于耐盐碱绒毛白蜡分子标记的辅助选择育种， 同时为克隆绒毛白蜡耐盐碱基因、基因序列分析奠定了良好的基础，为进一步了解绒毛白蜡抗盐碱的分子遗传学机理有积极意义。2)分子标记辅助选择操作简便，节约成本；绒毛白蜡为多年生木本植株，常规选育方法，周期长，成本高，费时费力。通过本发明只需进行简单的PCR扩增，即可有效的鉴定材料的耐盐性，避免了常规选育方法所需时间周期长及繁琐的筛选过程等缺点。3)本发明通过SCAR标记可对个体进行苗期鉴定，大大提高了育种效率，缩短了育种进程。
图I :高耐盐碱绒毛白蜡R36、R39和5株普通绒毛白蜡混合基因池DNA的RAPD分子标记S20-592筛选电泳谱带图。M-DL2000Mark ；0 :1_5株普通绒毛白蜡混合基因池DNA 的RAPD结果；R36、R39-分别为高耐盐碱绒毛白蜡的RAPD结果。图2 :SCAR标记在高耐盐碱绒毛白蜡和普通绒毛白蜡单株中的PCR电泳谱带图。 M-DL2000Mark ;R36、R39-分别为高耐盐碱绒毛白蜡；1_5 :普通绒毛白蜡单株。图3 :本发明应用SCAR标记对已经鉴定的抗感植株基因组DNA的电泳图谱。M DL2000Mark ;1_10 :R36的Fl代抗性植株10株；11-20 :R36的Fl代感性植株10株。
具体实施例方式实施例I :与耐盐碱基因相关联的RAPD多态性标记的获得一、材料高耐盐碱绒毛白蜡R36、R39和普通绒毛白蜡由山东省林业科学研究院东营分院刘德玺提供。二、小量法DNA提取I)取0.2g绒毛白蜡叶片，于液氮中研磨。加入800iil DNA提取缓冲液含有2% (w/v)CTAB,20mmoI/LEDTA(pH = 8. 0)UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% ￠-巯基乙醇，轻轻颠倒混匀；2)于65°C水浴中温育30min,每IOmin颠倒轻轻混勻，12000rpm,离心IOmin ；3)取上清700 ii I,加入等体积氯仿/异戍醇(24 I, V V),轻轻颠倒混勻，4°C, 12000rpm,离心 IOmin ；4)取上清600 ill，加入等体积氯仿/异戊醇(24 : I，V : V)，轻轻颠倒混匀，4°C， 12000rpm,离心 IOmin ；
6
5)取上清500 Ul，加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，_20°C静置30min ； 6) 4°C，12000rpm,离心 IOmin ；7)去上清，用预冷的75%乙醇洗涤沉淀2次，4°C，IOOOOrpm,离心5min ；8)在超净工作台干燥沉淀30min，加30 的灭菌ddH20溶解沉淀，待浓度和纯度检测后，置_20°C或_70°C冰箱保存备用。三、RAPD扩增多态性标记分析RAPD引物为S系列S1-S150，共150个，购自上海生物工程公司。优化的RAPD扩增体系为(I) PCR反应体系为IOX 反应缓冲液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5u l,30ng/u I 引物 P 1，模板 DNA(20ng)2ii l，2u/ul Taq DNA 聚合酶 0. 25 y 1，ddH20 14. 95 y I 总体积 25u I ；(2) PCR反应程序为95°C预变性 5min，94°C变性 30s，36。。退火 lmin，72°C延伸 2min，循环 44 次，72°C 延伸IOmin0取8li L扩增产物用I. 0%的琼脂糖凝胶电泳,GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相，电泳Marker和试剂为TAKARA公司生产。用150个随机引物，分别对高耐盐碱和普通低绒毛白蜡基因池进行RAH)扩增，发现只有S20引物的扩增产物在高耐盐碱基因池和普通低耐盐碱基因池中表现多态性，经3 次重复扩增，在两基因池间表现稳定、一致的差异，S20在高耐盐碱基因池扩增出特异条带 S20-592，而在普通基因池缺失这条带，获得了与耐盐碱性状相关联的的特异片断S20-592， 分子量大小为592bp。实施例2 :与耐盐碱基因相关联的SCAR标记的获得及鉴定一、特异片断S20-592的回收将PCR扩增出的特异片断S20-592DNA经I. 0%琼脂糖凝胶电泳后，用博大泰克生产的玻璃奶试剂盒回收，操作按照试剂盒说明书进行。二、连接反应连接反应体积为IOii 1，其中含回收的DNA 5 ii I (30 50ng)，PMD-18T Vector Iu I, T4连接酶I i! I，连接缓冲液I U 1，灭菌CldH2Ol u I。反应混合物充分混匀后，在16°C 连接12小时。三、转化I、从_70°C冰箱中取200 U I大肠杆菌DH5 a (本实验室制备保存)感受态细胞室温下使其解冻，解冻后立即至于冰上。2、加入10 U I连接混合物，摇匀后冰上放置30min。3、42°C热击混合物90s，热击后快速转移到冰上冷却2 3min。4、向离心管中加入800 ill液体LB培养基，37°C 180rpm振荡Ih后，浓缩菌液，去掉上清800 iil，取200 ill转化混合物涂布于固体LB培养基的平板上。将涂布好的平板在室温下正面向上放置30min后，倒置平板，放入37°C恒温培养箱中培养16-24h。待显现白色菌落后，挑取白色菌落，置于IOml的LB液体培养基中，37 °C 180rpm培养过夜至对数中期，用PCR方法鉴定，将阳性克隆的菌液送至上海生物工程公司测序。四、SCAR标记的获得及检测I、得到了长度592bp的特异片断SCAR标记，其核酸序列为ggacccttaccaaatgacaatcaatttctatgtgcttggtttgttcgtggaaaactggat60
tacttgctatgcctatagcaaatgactattacagaacaacaaagcaggtctggtgtgatc120
aatttgcaagttattcaatatagtttttggccatgtaaactcacggacggctgcagccat180
tgatctgtattcagcttcagctgaagatcttgatacagtgtgttgcttcttggacttcca240
tgacacaagggaattgcccaaaaagatacaatatcctgtaatcgactgtcttgtatccga300
acatgctgcccgatcagcatCBCBBCBBCCtttgagcagaagatcagatttgctagaaat360
gaataaccctgtcttgatgagttctacagataccttaggcgtgataagctgcctccagat420
gagactgtcttggggactgaaggaattgactcagaacttgtacaggattaaataaatctg480
gcctggtaatagttaggtacaaaatcctcccaacaagccttttgtaggcattaagatcat540
ctacaggctc ttcttcatcc tttctcaact 2、SCAR标记获得的PCR引物序列ttaggttgcacggtaagggtCC592根据SCAR标记序列,通过Primer软件设计了特异引物序列为正向引物FS20-592:5’ TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3’反向引物RS20-592 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’，由上海生物工程公司合成。3、SCAR标记检测用SCAR-PCR引物在高耐盐碱R36、R39和普通绒毛白蜡的5个单株中分别进行扩 +
>曰oPCR 反应体系为总体积为 25 ill，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 (天根生化科技有限公司)，FS20-592 (IOii mol/L) Iii 1，RS20-592 (10 u mol/L) I U 1，模板 DNA (20ng) 2u I, ddH208. 5 y I。PCR 反应条件为94°C预变性 4min，94°C变性 30s，55。。退火 45s，72。。I. 5min,循环 30 次，72°C延伸 IOmin0电泳结果扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察拍照。扩增结果表明，在高耐盐碱绒毛白蜡中扩增出592bp特异条带，而在普通绒毛白蜡单株中未扩增出特异条带(图2)。PCR扩增试剂和Marker购自TAKARA公司。实施例3 :耐盐碱绒毛白蜡的SCAR标记在用于辅助选择育种中的应用取已鉴定的稳定的抗盐植株R36的Fl代抗性植株10株及感性植株10株，分别用 CTAB法提取各个植株的DNA，然后以提取的DNA为模板进行SCAR分析。具体的，分别以上述基因组DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物(引物I : 5’TGCTTGGITTGITCGTGG 3’；引物 2 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)进行 PCR 扩增，反应总体积为25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 iU (天根生化科技有限公司)，引物I (10 ii mol/ L) I u 1，引物 2(10 ii mol/L) Iii l，20ng 基因组 DNA2ii 1，ddH20 8. 5 u I0在55°C的退火温度下，进行PCR扩增，反应参数为94°C预变性4min，94°C变性 30s, 55°C退火45s, 72°C I. 5min,循环30次，72°C延伸IOmin0 PCR扩增产物在I. 0%琼脂糖凝胶电泳上分离，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。
电泳Marker DL2000 和试剂为 TAKARA 公司。分析结果如图3。从图3中可见，对抗性植株1-10分别以SCAR特异性引物进行扩增，结果分别扩增出了特异性谱带。而在感性植株11-20的扩增产物中都没有扩增出任何产物。这再一次证实了 SCAR标记检测的可靠性及其应用苗期与抗盐性状相关联的分子标记作为抗盐育种辅助选择的可行性。
权利要求
1.一种耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记，其特征在于，所述SCAR标记是全长592bp的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记，其特征在于所述SCAR标记引物是正向引物FS20-592 :5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3’反向引物RS20-592 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’。
3.权利要求I所述耐盐碱绒毛白蜡的SCAR标记在用于辅助选择育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种绒毛白蜡耐盐碱SCAR标记，该SCAR标记是全长592bp的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的SCAR标记可广泛用于耐盐碱绒毛白蜡分子标记的辅助选择育种，同时为克隆绒毛白蜡耐盐碱基因、基因序列分析奠定了良好的基础。本发明可实现对个体进行苗期鉴定，大大提高了育种效率，缩短了育种进程。
文档编号C12N15/11GK102533745SQ20121000644
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者刘翠兰, 夏阳, 李丽, 李双云, 燕丽萍 申请人:山东省林业科学研究院