用于人类KRAS基因突变检测的试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及的是一种用于人类kras基因突变检测的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：目前，肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌约(nsclc)占80％，且就诊时80％己失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。iiib/iv期非小细胞肺癌2年生存率仅10％-20％，中位生存时间仅10-12月。因此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法，为晚期nsclc的治疗带来了新的希望。ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——h-ras、k-ras和n-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。k-ras因编码21kd的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，k-ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。她参与细胞内的信号传递，当k-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。k-ras基因就像体内一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的k-ras基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。k-ras基因检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。看k-ras基因有没有突变，可以筛选出抗egfr(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。对于没有突变的患者，则能减少不必要的治疗费用和毒副作用。目前在欧美，k-ras检测已成为大肠癌患者内科治疗前必做的常规检查。突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，arms)也叫等位基因特异性pcr，该法是在pcr基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的pcr技术。其依据的基本原理是taqdna聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此对于3′末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，扩增反应终止。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起。因此所提取的dna常带有大量野生型dna，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。特异性探针法如以scorpionsarms为代表的英国dxs和中国厦门adx的kras检测试剂盒虽然检测灵敏度高，但其检测费用较高，不适合国内nsclc患者的常规检测和筛查，因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高的检测kras基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断的时效性要求。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种高灵敏度的用于人类kras基因突变检测的试剂盒和反应体系，本发明的另一目的是提供一种用于检测kras基因突变的检测方法。本发明是通过以下技术方案实现的：用于人类kras基因突变检测的试剂盒，其特征在于：包括7种基因的特异性引物对和7条与特异性引物配合使用的探针引物，所述的特异性引物对和探针引物为：优选的，还包括质控系统或/和内控系统，所述的质控系统为一对质控引物和相应的质控探针，所述的内控系统为一对内控引物和相应的内控探针，具体如下：质控引物：上游引物：5’aatataaacttgtggtagttgga3’下游引物：5’ttcgtccacaaaatgattctga3’质控探针：5’ctgtatcgtcaaggcactctt3’；内控引物：上游引物：5’cccagcagtttggccc3’下游引物：5’tccttaatgtcacgcacgat3’内控探针：5’accaccacggccgagcgg3’。优选的，所述的试剂盒还包括kraspcr反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和depc水。优选的，所述的试剂盒可用于血清游离dna样本、组织样本或穿刺样本的kras基因突变的检测。作为优选，包括pcr扩增试剂和对照试剂，所述的扩增试剂、对照试剂的组成成分和终浓度如下：用于人类kras基因突变的检测方法，所述的方法包含以下步骤：(1)样本dna的提取血清游离dna提取和组织样本dna提取；(2)pcr反应体系的配制分别配制pcr反应液16ul，酶系1、2ul、引物探针混合液2ul，模板dna5ul，阴性对照和质控视为样本，作相同处理；(3)结果判读：根据荧光pcr扩增仪显示的ct值判断检测结果：利用特异性引物和荧光探针进行pcr检测，突变和质控由fam指示，内控由hex信号指示，通过计算δct的大小进行判断，反应管的δct值＜δctcut-off值时，则样品为该反应管对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。δct值＝突变样本ct值-质控ct值表cutoffδct值检测靶点cutoffδct值12cys1012ser1012arg812val1212asp812ala1213asp10本发明提供了用于人类kras基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括pcr反应缓冲液、引物探针混合液、酶系1、阳性对照、阴性对照。引物探针混合液包含突变位点基因和内控引物探针，质控基因和内控检测引物探针，突变和质控探针标记fam荧光素，内控标记hex荧光素，质控及内控均作为结果判读的一部分，质控基因选择是人类kras基因相对保守的区段，内控选择的是人β-actin保守基因，双控体系共同用于监控血浆样本dna质量和pcr反应过程，与现有技术相比，本发明的有益效果是：1)高灵敏度：可在100ng野生型人类基因组背景下检测出1％微量突变模板，减少了假阴性结果的出现；2)全封闭反应，避免假阳性结果的发生；3)双控反应体系，质控及内源对照，有效检测pcr扩增及核酸提取。附图说明图1为12cys灵敏度结果图2为12ser灵敏度结果图3为12arg灵敏度结果图4为12val灵敏度结果图5为12asp灵敏度结果图6为12ala灵敏度结果图7为13asp灵敏度结果图8为临床阳性样本用12cys检测结果图9为临床阳性样本用12ser检测结果图10为临床阳性样本用12arg检测结果图11为临床阳性样本用12val检测结果图12为临床阳性样本用12asp检测结果图13为临床阳性样本用12ala检测结果图14为临床阳性样本用13asp检测结果具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1利用本发明实时荧光pcr检测kras7种基因突变的方法包括如下步骤：1、核酸提取以石蜡包埋组织为例，按照推荐的qiaampdnaffpetissuekit说明书进行石蜡包埋组织基因组dna的提取。2、pcr反应体系的配制(25ul)试剂名称加入量pcr反应液16ul酶系12ul引物探针混合液2ul模板dna5ul所述的模板dna包含样本dna和阴性、阳性对照dna。3、pcr扩增实时pcr扩增条件为：50℃2min，1个循环；95℃5min；95℃10s，55℃15s,72℃30s，5个循环；95℃10s，60℃45s(收集fam和hex荧光信号)，40个循环。4、结果判定1)检测结果除阴性对照外，突变反应管的内控信号hex应有扩增曲线，且ct≤33；若ct＞33，则提示样本dna模板量偏低或存在pcr抑制剂，需重新提取或者增加pcr模板量再做，但是如果管内fam有信号，可能是由于突变的扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。2)质控管fam信号ct＜21，提示样品加入量过高，需减少样本加入量再实验；质控管fam信号ct＞26或阴性，提示该样本加入量过低或提取失败，需要增加样本量再实验或重新提取。3)质控管fam信号21≤ct≤26a：arms引物管ct＜30，样本结果判读为阳性。b：arms引物管＞阴性临界值或无扩增曲线，样本结果判读为阴性。c：相应arms引物管30≤ct值＜阴性临界值(如下表)，且其与质控管fam信号的δct≤△ctcut-off值，该样本结果判读为阳性；反之则判读为阴性。实施例2利用本发明检测kras基因突变阳性患者石蜡包埋组织样本10例，并与测序结果进行对照，结果：检测出12val阳性4例，12asp阳性5例，13asp阳性1例，与测序法符合率100％。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12