清建立较好范围的样本缓冲液。底栏： 为了获得转移癌血清的较高信号而尝试的不同封闭缓冲液。
[0066] 图17 :前列腺癌（N = 5)和肺癌（N = 10)中FGFR2、FGFR3和FGFR4的参考范围。
【具体实施方式】
[0067] 可溶性FGFR浓度的早期分析有利于了解癌的状态（治疗前和治疗后）并将有助 于选择靶向FGFR的特定候选药物。此类分析也提出关于FGFR药物的作用模式的线索。因 此，迫切需要对于FGFR灵敏和特异的合适的诊断测定。
[0068] 尽管证明能成功检测其他可溶性生长因子受体，但先前尝试获得可靠检测sFGFR 的多个同种型的合适的测定未能成功。令人惊奇的是，使用基于微球的多重免疫测定技 术（具体地，本文和美国专利6, 599, 331、6, 592, 822和6, 268, 222中所述的"Luminex 100/200?"平台，研发出准确测量生物样本中sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的测定。基于微球 的多重免疫测定技术为夹心测定。术语"夹心测定"是指其中抗原夹在两种结合试剂（通 常为抗体）之间的免疫测定。第一结合试剂（捕获抗体）连接至微球，并且第二结合试剂 (检测抗体）包含可检测基团。可检测基团的例子非限制地包括例如：荧色物、酶、结合第 二结合试剂的表位（例如，当第二结合试剂/抗体为鼠抗体时，其通过荧光标记的抗鼠抗体 而检测），例如抗原或结合对中的成员诸如生物素。
[0069] 聚苯乙烯微球为该测定的重要组分。这些微球小珠用两种光谱上不同的荧光团内 部染色。使用精确比率的这些荧光团，创建由具有特定光谱位置的100种不同微球组组成 的阵列。每种微球组可在其表面上具有不同的反应物。本申请中，反应物称为"捕获抗体"。 因为微球组可通过它们的光谱位置来区分，故可将它们混合，从而使至多100种不同分析 物在单个反应容器中同时测量。偶联至报道分子（本申请中称为"检测抗体"）的第三荧光 团定量发生在微球表面处的生物分子相互作用。当微球被Luminex分析仪中两种独立激光 穿过时，在快速流动的流体流中单独询问它们。根据样本反应，高速数字信号处理基于微球 的光谱位置将微球归类并在表面上将反应定量在几秒内。
[0070] 对于本文所述的测定，基于微球的多重免疫测定提供若干优势：
[0071] ?由于不需要针对每种单个sFGFR的独立试剂盒，故测定成本廉价。
[0072] ?由于一个试剂盒可测试多个sFGFR，故大大降低了运行测定所需生物样本的量。
[0073] ?由于不需要预先处理或滴定生物样本，故测定的定量测量提供高的再现性。
[0074] 鉴于这些原因，尽管能够在本发明背景下使用其他免疫测定诸如放射性免疫测 定，仍优选基于微球的多重免疫测定。
[0075] 实M
[0076] 提供了以下非限制性实例来进一步说明本发明。本领域的技术人员将认识到以下 实例中公开的技术符合发明人已发现在受权利要求书保护的发明实践中作用良好的代表 方法，从而应被认为构成其实践模式的实例。然而，按照本公开，本领域的技术人员应认识 到在不脱离本发明的实质和范围下，可对所公开的具体实施例进行多种改变而仍获得相似 或类似的结果。
[0077] 实例1 :牛物样本的采集和储存
[0078] 由于sFGFR经蛋白水解裂解之后多数释放到循环中，故使用血液、血清和血浆样 本[Bioreclamation，LLC(Westbury，NY)]来研发和校验多重免疫测定。由已在国家注册的 采血师从自愿的健康志愿者的肘前区域采集血液样本并将该血液样本在450-500mL干燥 采集袋中于冷藏库内过夜以凝结。在5°C下以2800xg离心二十分钟来分离血清。使用血 浆提取装置将所分离的血清转移到转移袋中以确保无红血细胞污染。将人血浆采集在包含 乙二胺四乙酸钾的采集袋中，缓慢混合五分钟并于室温下静置三十分钟。将该袋在5°C下 以2800xg离心二十分钟。使用血浆提取装置将所分离的血浆转移到转移袋中以确保无红 血细胞污染。在分离成冻存管中的等分试样之前，将人血清和人血浆二者在4°C下储存至多 一周并将它们于-80°C冷冻直至使用。
[0079] 实例2 :多重免痔测宙的研发
[0080] 成功实施基于微球的多重免疫测定用于生物样本中sFGFR检测需要研发和优化 规程。第一，必须鉴定出引起最高灵敏测定的试剂。评价的第一组试剂为用于SFGFR2、 SFGFR3和SFGFR4的捕获和检测抗体对。探宄了几种不同来源的的抗体；然而，由于列于表 1中的抗体对使sFGFR2、sFGFR3和SFGFR4检测的范围最大化，故将该抗体对用于多重体系 中。
[0081] 表1 :用于律立FGFR2、FGFR3和FGFR4测宙的捕获和检测抗体的组合。
[0082]
[0083] 所制备的该测定的下一组分为偶联捕获抗体的微球。将捕获抗体特异性羧化 (《-COOH》）至5. 6微米聚苯乙烯微球，如下所述：抗FGFR2羧化至小珠# (88)，抗FGFR3羧 化至小珠# (16)，并且抗FGFR4羧化至小珠# (79)。这些区对应于使用Luminex 100/200? 体系的100个潜在唯一染色区中的3个。使用专有缀合体系进行靶捕获抗体至聚苯乙烯微 球的偶联，该体系使用与得自Bio-Rad Life Sciences (目录号171-406001)的Bio-P丨exU 胺偶联试剂盒类似的程序。简而言之，经由涉及蛋白伯氨基基团和聚苯乙烯微球表面上结 合的羧基官能团的碳二亚胺反应，得到了靶捕获抗体至羧化的聚苯乙烯微球的共价偶联。 清洗之后除掉未结合的蛋白，共价连接即使在长期储存后仍为稳定的。根据制造商规程使 用Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce，目录号21327)使SFGFR2和SFGFR3的检测抗体生物素酰 化，而购买已连接生物素标记的SFGFR4的检测抗体。
[0084] 评价的另一组试剂为用于样本稀释、封闭步骤和孵育的缓冲液。用于多重测定 的典型缓冲液是基于PBS的或基于Tris的。孵育和稀释效果最好的缓冲液为含1% BSA 的PBS，并且非特异性蛋白封闭效果最好的缓冲液为含1%牛Y球蛋白和免疫球蛋白G的 PBS〇
[0085] -旦制备出用于免疫测定的试剂，便使用之后的规程以定量生物样本中的FGFR2、 SFGFR3 和 SFGFR4 :
[0086] ?对于所有三种sFGFR(每种分析物每孔1800个小珠），在添加免疫球蛋白G的 PBS中将5 y L稀释的带标记的捕获抗体的微球与5 y L由1 %牛y球蛋白组成的封闭剂 (MP Biomedicals, Santa Ana, CA，目录号 82041)混合。
[0087] ?将该混合物添加到96孔平底微量滴定板。
[0088] ?测试之前，使即将使用的样本在室温下即时解冻。
[0089] ?将10 U L以1:5稀释于包含防腐剂（叠氮化钠）的4% BSA缓冲液中的标准物、定 量对照、或血清添加到所述板，用移液管混合样本，并且在孵育所述板一小时而无需震动。
[0090] ?将10yL生物素酰化的检测抗体（对于所有三种分析物，稀释于含防腐剂的1 % BSA缓冲液以得到3yg/mL的终浓度）添加到每个孔，完全混合，并且在室温下孵育一小时。
[0091] ?将10yL稀释至100yg/mL的链霉亲和素-藻红素添加到每个孔，完全混合，并 且于室温下孵育三十分钟。
[0092] ?将过滤膜微量滴定板用100yL含叠氮化钠的基于BSA的洗涤缓冲液预先润湿， 之后经由真空歧管装置抽吸。
[0093] ?将平底微量滴定板中的反应内容物转移到过滤板的相应孔。真空抽吸所有孔，并 且用100 yL洗涤缓冲液洗涤内容物两次。
[0094] ?最终洗涤之后，向每个孔添加100yL洗涤缓冲液，并且通过充分混合来重悬所 述微球。
[0095] ?然后，在使用专有分析软件的Luminex 100/200?阅读器上分析所述板。对于每 块板，使用专有软件针对每种sFGFR创建标准曲线。SFGFR2和SFGFR3的标准曲线使用5参 数逻辑回归，并且SFGFR4的标准曲线使用4参数逻辑回归。
[0096] 实例3 :多重免痔测宙的统计柃骀
[0097] 基于美国食品和药物管理局的指导方针（美国卫生和人类服务部，药物评价 与研宄中心（⑶ER)，以及兽药中心（CVM)，行业指南，生物分析方法校验，2001年5月， http://www. fda. gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/UCM070107. pdf)，研发了需要全部校验sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4多重免疫测定 的校验程序。该程序包括最佳样本基质、测定选择性、通过标准曲线确定的线性范围、最小 可检测剂量（LDD)、定量下限（LL0?、精度、绝对回收率、稀释线性度、基质干扰、冷冻/解冻 稳定性、室温下稳定性和参考范围的评定（图1)。
[0098] 血浆和血清样本的比较：由于在测宙中伸用血液来测量sFGFR2、sFGFR3和SFGFR4 的含量，故比较血浆或血清以鉴定最佳生物基质。如图2、图3和图4所示，当测定血清时， sFGFR回收一致地为最佳的。因此，血清为用于进一步校验分析的最终选择的基质。尽管适 于目的的校验也将需要建立鉴定基质的最佳选择，本发明所述的多重免疫测定方法也可用 于其他生物样本（脑脊液、尿液、淋巴液、唾液、汗液、胸膜液、滑液、房水、泪液、胆汁、胰腺 分泌物）。
[0099] 测宙诜择件：由于在同一样本孔中测试FGFR2、sFGFR3和SFGFR4,故探知三种分析 物之间无显著交叉反应性至关重要。为了研宄交叉反应性，对最高浓度的SFGFR3和SFGFR4 信号进行FGFR2捕获抗体测试。类似地，对所有其他组合进行评价，并且仅在FGFR4捕获抗 体和最高浓度SFGFR2之间发现1. 6%交叉反应性（图5)。
[0100] 标准曲线：伸用可从R&D Systems Duosets获得的总FGFR2a标准物（部件号 841650)，总FGFR3标准物（部件号841879)和总FGFR4标准物（部件号842742)(分别为 目录号DYC665、DYC766和DYC685)来生成标准曲线。每种sFGFR的标准曲线通过首先在鱼 血清/BSA缓冲液中创建三种标准物的高标准混合物而制得：对于FGFR2为100ng/mL，对于 FGFR3为15ng/mL，并且对于FGFR4为25ng/mL。通过对37 y L每种标准物添加88 y L标准 稀释剂来对该高标准物进行一连串七次的稀释。FGFR2、FGFR3和FGFR4的标准曲线范围分 别为 100ng/mL-0. 020ng/mL，15ng/mL_0. 003ng/mL 和 25ng/mL_0. 005ng/mL。在每块板上运 行每种分析物的标准曲线，并且将所述值平均，计算出运行之间的CV% (图6、图7和图8)。 FGFR2、sFGFR3和SFGFR4的平均CV分别为8. 38%、6. 38%、5.