专利名称：Lect2蛋白在制备病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及LECT2蛋白的应用，具体涉及LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用。
背景技术：
白细胞衍生趋化因子(leukocytecell-derived chemotaxin 2, LECT2 蛋白)是一个多功能的蛋白质，分子量约为16 kDa，含三个分子内ニ硫键，该分子结构简单，无糖基修饰。LECT2 —开始被认为是ー种嗜中性粒细胞趋化因子，随着研究的深入，人们发现它还与骨骼和血管生长、肝移植损伤修复、植物毒素、非病原抗原等引起的病理和生理过程有关，如公布号为CN102159238，名称为抑制病理性血管发生作用的组合物，就公开了包括有效量的LECT2蛋白制备成抑制病理性血管发生作用和/或细胞增生性疾病的组合物。但是目前尚未发现LECT2对病毒有预防和治疗作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用；其通过激活巨噬细胞，诱导干扰素Y和粒细胞集落刺激因子等抗病毒细胞因子的表达，从而提高巨噬细胞活性，增强动物免疫能力，抑制流感病毒和逆转录病毒的复制。本发明的上述技术问题所采用的技术方案为LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用；所述病毒为正粘病毒科病毒和逆转录病毒科病毒。如甲型流感病毒和小鼠白血病病毒
坐寸ο所述LECT2蛋白为重组LECT2蛋白；重组LECT2蛋白的制备可以依据Ovejero等&开白勺し identiiication of the leukocyte ceil_derived chemotaxin 2 as a directtarget gene of beta-catenin in the liver，，( Hepatology, 2004 年 7 月、40(1)，167-176 )方法进行制备。可以在动物细胞、低等真核生物或原核生物中重组表达，如在粟酒裂殖酵母、克鲁维酵母菌株、念球菌属或任何可表达异源性蛋白的酵母菌中表达得到重组LECT2蛋白。或在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或细菌等原核生物进行表达得到重组LECT2蛋白。LECT2蛋白可在哺乳动物中提取,可以依据Yamagoe等公开的“Purification andprimary amino acid sequence of a novel neutrophil chemotactic factor LECT2，，、Immunol Lett, 1996年8月、52 (I)，9-13)方法进行提取，如包括猴COS细胞、CHO细胞、人类肾脏293细胞、人类表皮A431细胞、人类Colo205细胞、3T3细胞、CV-I细胞、其它经转化的灵长类细胞、正常的二倍体细胞、由体外培养的原生组织衍生的细胞株、原生移植体、Hela细胞、老鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞等动物细胞中提取。LECT2蛋白制备的病毒药物，可以是纯制剂，也可以是与药学上可接受的载体组成的各种制剂，如注射剂、ロ服液、丸剂、片剂、胶囊等。可以是ロ服、非肠胃吸入、直肠、阴道、皮内、经皮或局部给予；本发明的LECT2蛋白可一次给予，24小时内多次给予或连续给予，剂量可以为每天纯LECT2蛋白O. 02 -2 μ g /g体重。
与现有技术相比，本发明的优点在于LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用，其中病毒为正粘病毒科病毒和逆转录病毒科病毒，大量试验表明该LECT2蛋白可以通过激活巨噬细胞，诱导干扰素Y (IFN-Y)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等抗病毒细胞因子的表达，从而提高巨噬细胞活性，增强动物免疫能力，抑制流感病毒和逆转录病毒的复制，抑制F-MLV感染小鼠的脾增大，提高流感病毒感染小鼠的存活率效果显著，且无副作用。
图I为LECT2蛋白提高巨噬细胞抑制流感病毒复制能力的示意 图2为LECT2蛋白提高流感病毒感染小鼠存活率的示意 图3为LECT2蛋白处理的巨噬细胞回输后提高流感病毒感染小鼠存活率的示意 图4为LECT2蛋白抑制F-MLV引起的小鼠脾增大的示意 图5为LECT2蛋白减少小鼠血清中F-MLV的含量的示意 图6为LECT2蛋白处理的巨噬细胞回输后减少F-MLV引起的小鼠脾增大的示意图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进ー步详细描述。实施例I
1.1材料甲型流感病毒株(H1N1，A/Puerto Rico/8/1934)购自浙江省医学科学院，病毒复苏后接种9日龄SPF (无特定病原)鸡胚，72小时培养收取感染鸡胚尿囊液，检测病毒血凝效价，SPF鸡胚传至2 3代，-70°C保存。LECT2蛋白为重组LECT2蛋白，重组LECT2蛋白的制备可以依据OvejeiO等公开方法进行制备，在此不作叙述。I. 2重组LECT2蛋白促进巨噬细胞IFN- Y分泌
I.2. I肺巨噬细胞培养小鼠麻醉并固定，颈部去毛并消毒，在颈部正中切ロ，暴露剥离气管。并在气管近端穿线打活结，活结要比较松，在所打活结的远端，剪开气管的1/2，行气管插管，插入后线打死结。用5 ml注射器抽取I. 2 ml的灭菌生理盐水，通过气管插管注入气管内，反复抽吸3次，将液体抽出，放入灭菌离心管内。重复上面的操作两次，灌洗液置于离心管，1000转/分钟离心10分钟。弃上清，沉淀用灭菌生理盐水冲洗，悬浮细胞后再离心，重复三次。然后弃上清，用1640培养液(invitrogen公司)稀释成lX106/ml,于六孔培养板(corning公司)培养。37° C 5% ニ氧化碳培养2小时后，吸取上面的液体，重新加入含胎牛血清(FBS) (invitrogen公司)的1640培养液，继续培养，等细胞贴壁后，获得肺泡巨噬细胞培养液。I. 2. 2 Elisa检测重组LECT2蛋白加入培养的肺巨噬细胞，10小时和20小时以后分别收集细胞培养上清，采用IFN-Y和G-CSF酶联免疫检测试剂盒(Elisa，R&D system公司)，检测上清中IFN-γ的表达。结果发现巨噬细胞上清培养中的IFN-Y和G-CSF表达含量显著性上调，在依5 yg/ml的量将纯重组LECT2蛋白加入至巨噬细胞培养液中，20h后，IFN-Y 由 O pg/ml 上调到 259. 8 pg/ml，而 G-CSF 由 70. O pg/ml 上调到 1140. O pg/ml。该结果说明重组LECT2蛋白处理巨噬细胞可分泌抑制病毒活性的蛋白。
I.3重组LECT2蛋白抑制流感病毒在肺巨噬细胞内复制实验例用纯重组LECT2蛋白(剂量5 μ g/ml)处理肺巨噬细胞培养液24小吋，对比例用相同剂量的生理盐水处理肺巨噬细胞培养液24小时，再将甲型流感病毒株按感染复数(MOI) O. 01，加入培养的肺巨噬细胞培养液中。于感染0、10、20小时时间点，收集上清液，稀释以后为病毒悬液，用于检测病毒效价。检测方法将狗肾转化细胞(MDCK细胞)接种入6孔板，用DMEM培养基(invitrogen公司)培养24-36 h后长至100%满，弃掉上清，将细胞先用磷酸缓冲液(PBS)洗2次，再用无血清DMEM培养基洗I次。再将病毒检悬液加入孔中，每组三个复孔，毎次设两个6孔板重复，在37° C孵育I h后，弃掉上清，将细胞先用PBS洗2次，再用无血清DMEM培养基洗I次，以去除没有吸附的病毒粒子。预先熔化3%的低熔点琼脂糖，放至室温后取6 ml加入到等量的预热至37° C的无血清DMEM培养基和胰酶(invitrogen公司),混勻后加入孔中，
Iml/孔，室温正放30 min以上，待琼脂凝固后，倒置于37° C培养箱继续培养2_4天，待噬斑出现于显微镜下观察。根据噬斑的数量和病毒的稀释倍数计算病毒原液的噬斑效价，采用PFUs/ml表示(PFU为卩遼斑形成单位-plaque formation unit的缩写)。结果如图I显示，实验例用重组LECT2蛋白处理肺巨噬细胞明显抑制流感病毒的复制，甲型流感病毒感染IOh、20h时间点重组LECT2处理的巨噬细胞中病毒含量都大大低于生理水处理的巨噬细胞中病毒含量，20h点的重组LECT2处理的巨噬细胞中病毒含量仅为55. O PFUs/ml，而对比例用生理盐水处理的肺巨噬细胞流感病毒出现快速复制，病毒含量达到1540.0 PFUs/ml。该结果说明重组LECT2蛋白处理的巨噬细胞可以抑制流感病毒的复制。I. 4重组LECT2蛋白提高流感病毒感染小鼠的存活率将1.0X104 PFU甲型流感病毒株溶于30 μ I PBS，通过鼻内注射感染小鼠，实验组和对照组各16只小鼠。在病毒感染I天以后，实验组按小鼠体重O. 2 μ g/g剂量腹腔注射的纯重组LECT2蛋白，对照组注射相同剂量的生理盐水。每天记录小鼠存活率，持续20天。结果如图2显示，病毒感染以后20天，对照组小鼠存活率为31%，而实验组小鼠存活率为75%，该结果说明重组LECT2可用于治疗流感病毒感染小鼠，提高其存活率。I. 5重组LECT2蛋白处理的巨噬细胞回输可提高流感病毒感染小鼠的存活率采用纯重组LECT2蛋白(5 μ g/ml)、生理盐水分别处理巨噬细胞培养液24 h。将I. OX IO4 PFU甲型流感病毒株溶于30 μ I PBS通过鼻内注射感染小鼠。在病毒感染I天以后，采用细胞刮刀将巨噬细胞培养液中贴壁巨噬细胞刮下来，制备巨噬细胞悬液，2Χ IO6个巨噬细胞注射到每ー只小鼠。生理盐水和重组LECT2蛋白处理的巨噬细胞各注射18只小鼠。每天记录小鼠存活率，持续20天。结果如图3显示，病毒感染以后20天生理盐水处理巨噬细胞回输组小鼠存活率为22%，而重组LECT2蛋白处理巨噬细胞回输组小鼠存活率为72%，该结果说明重组LECT2蛋白通过巨噬细胞来抑制小鼠体内的流感病毒，同时也说明重组LECT2蛋白不仅可以直接用于治疗流感病症，也可以通过激活免疫细胞来治疗流感病症。实施例2、与实施例I基本相同，所不同的只是重组LECT2蛋白由直接从动物中提取的LECT2蛋白替代，实施方法同上，在此不一一列挙，结果提取的LECT2蛋白都具有相同的上述效果。HlNl病毒也可以由其它正粘病毒科成员替代，可以得到上述效果。实施例3
2.I LECT2蛋白处理抑制小鼠白血病病毒(MuLV，其中Friend型缩写为F-MLV)感染引起的小鼠脾增大=F-MLV引自美国经典培养物收藏中心，经小鼠体内传代，制成10%脾悬液，-70°C保存。并测定其病毒滴度PFU。把小鼠随机分为正常组(未注射F-MLV +生理盐水处理)、对照组(注射F-MLV+生理盐水处理)、实验组(注射F-MLV+ LECT2处理)，每组小鼠各为12只，除正常组外，F-MLV注射量为每只小鼠通过腹腔注射给与0. 5ml病毒液(病毒滴度100 PFU)。实验组在注射F-MLVl小时后用纯LECT2蛋白(0.2 U g/g)腹腔注射，正常组和对照组用相同剂量的生理盐水代替LECT2蛋白。注射F-MLV后30天，处死小鼠，小鼠处死前禁食禁水4小时以上，称量小鼠体重，脾重，脾指数=小鼠脾重/小鼠体重*100，结果如图4发现，LECT蛋白2处理的实验组小鼠脾指数为2. 69%，生理盐水处理的对照组小鼠脾指数达到12. 67%，正常组小鼠脾指数为0. 61%，该结果说明重组LECT2蛋白可抑制F-MLV感染小鼠的脾肿大，LECT2蛋白可明显减轻F-MLV引起的病症。2.2 LECT2蛋白处理减少了 F-MLV病毒感染模型小鼠血清中的病毒含量注射F-MLV后30天，取上述2. I各组小鼠的全血标本，室温静置I小时，4° C离心10分钟，小心吸取上层血清，于_70°C保存备用。采用荧光定量PCR的方法确定血清中病毒的含量。突光定量 PCR 方法可以依据 He 等公开！“Development of a real-time quantitativereverse transcriptase PCR assay for detection of the Friend leukemia virus loadin murine plasma” (Journal of Virological Methods,2008 年 2 月、147(2),345-350)的方法进行制备，在此不作叙述。从血清里提取病毒RNA，溶于RNAase灭活的水中，转录成cDNA。采用20 U I Taqman荧光定量PCR体系(T0Y0B0公司)检测病毒含量。反应在荧光 定量PCR (ABI公司)仪上进行，反应程序为95°C，预变性10 s ；95°C 10 s, 60°C 30 s,40个循环。结果如图5显示，实验组小鼠的病毒含量仅为对照组小鼠的病毒含量的7. 1%。该结果说明LECT2蛋白处理，可抑制F-MLV在体内的增殖。2. 3 LECT2蛋白处理的巨噬细胞回输减少F-MLV引起的小鼠脾增大巯基乙酸肉汤注射小鼠之后4天脱颈处死小鼠,75%乙醇浸泡5min。用不完全1640培养基5ml反复灌洗腹腔，收集灌洗液，4°C，离心10 min。用完全1640培养基(含10% FBS，100kU/L青霉素和100 mg/L链霉素)重悬细胞，进行细胞计数和台盼蓝染色，检测细胞存活率大于95%，调整细胞浓度至2X IO6 ml，铺于24孔板内，置于CO2培养箱中(37°C，5% CO2)培养2小时后洗去未贴壁细胞，剩余贴壁细胞即原代腹腔巨噬细胞，原代腹腔巨噬细胞用LECT2蛋白(5U g/ml)或者生理盐水分别处理24小时。每只小鼠通过腹腔注射给与0. 5 mlF-MLV病毒液(100 PFU)，在小鼠感染F-MLV病毒I天以后，采用细胞刮刀将贴壁巨噬细胞刮下来，制备巨噬细胞悬液，2X IO6个巨噬细胞注射到每一只小鼠，LECT2蛋白和生理盐水处理的巨噬细胞各注射8只小鼠，感染后30天，处死小鼠计算脾指数，结果如图5、6发现，LECT2蛋白处理的巨噬细胞回输的小鼠脾指数为2. 92%，生理盐处理的巨噬细胞回输的小鼠脾指数为
11.94%，该结果说明LECT2蛋白处理可能是通过激活巨噬细胞来达到抑制F-MLV增殖的效果。
实施例4、与实施例3基本相同，所不同的只是直接提取的LECT2蛋白由重组LECT2蛋白替代，实施方法同上，在此不一一列举，结果重组LECT2蛋白都具有相同的上述效果，F-MLV病毒可以由其它型的MuLV病毒替代，也可以为HIV病毒替代等，者具有上述实施例3相同的结果。实施例5
LECT2蛋白对小鼠毒性检测采用20 u g/g的纯LECT2蛋白或重组LECT2蛋白的剂量注射小鼠一周内，未产生明显的病理症状，未发生死亡。采用2iig/g的LECT2蛋白对小鼠腹腔注射两个月，未发现毒性作用。该结果说明LECT2蛋白对实验动物无毒无害。
权利要求
1.LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用，其特征在于所述病毒为正粘病毒科病毒和逆转录病毒科病毒。
2.如权利要求I所述的LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用，其特征在于所述LECT2蛋白为重组LECT2蛋白。
3.如权利要求I所述的LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用，其特征在于所述正粘病毒科病毒为甲型流感病毒。
4.如权利要求I所述的LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用，其特征在于所述逆转录病毒科病毒为小鼠白血病病毒。
全文摘要
本发明公开了LECT2蛋白在制备病毒药物中的应用，其中病毒为正粘病毒科病毒或逆转录病毒科病毒，该LECT2蛋白可以通过激活巨噬细胞，诱导干扰素γ和粒细胞集落刺激因子等抗病毒细胞因子的表达，从而提高巨噬细胞活性，增强动物免疫能力，抑制流感病毒和逆转录病毒的复制，抑制F-MLV感染小鼠的脾增大，提高流感病毒感染小鼠的存活率效果显著，且无副作用。
文档编号A61P31/16GK102671187SQ20121007377
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者史雨红, 虞朝辉, 陆新江, 陈炯 申请人:宁波大学, 浙江大学医学院附属第一医院