专利名称：麝香水溶性提取物提高神经干细胞电穿孔转染效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高神经干细胞电穿孔转染率的方法，特别是利用麝香提取物来提高神经干细胞电穿孔转染率的方法。
背景技术：
电穿孔法是分子生物学中用于研究基因功能的技术之一，其原理是被转染的细胞受到短暂的电脉冲，导致细胞膜上形成短暂的孔，使外源DNA或大分子进入细胞内。提高电穿孔转染的效率是技术的关键。
麝香来源于麝科动物林麝(Moschus berezovskii Flerov)、马麝(Moschus sifanicusPrzewalski)或原麝(Moschus mischieferus Linnaeus)成熟雄体脐下腺囊中的分泌物，是名贵的中药材。性温味辛，归心脾经，具有开窍醒神、活血通经、消肿止痛之功效。七十年代中期，中外学者开始对麝香化学成分进行了系统的研究，目前已证实的化学成分有麝香酮、麝香吡啶、蛋白质和多肽、脂肪酸、酯和蜡、胆甾醇等。对麝香功能的研究表明，它具有抗炎、免疫调节、强心等作用，还能引药透达全身、穿透病所的广谱作用。在研究麝香水溶性提取物对大鼠神经干细胞生长分化的影响过程中还发现低浓度麝香水溶性提取物对细胞的生长无明显影响，但可以显著地提高大鼠神经干细胞的电转染效率，因此有望利用麝香水溶性提取物开发增强细胞电转染的试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用麝香提取物来提高神经干细胞电转染率的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案本发明的一种麝香水溶性提取物提高神经干细胞电穿孔转染率的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为a.配制麝香提取物的水溶液；b.带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒pEGFP-C1的DNA抽提；c.大鼠神经干细胞的分离和培养，采用的基础培养液的组成为DMEM/F12的体积比为1∶1，100U/mL的青霉素和链霉素，2％的B27；原代培养液为基础培养液分别加20ng/mL的EGF和bFGF，得到待转染的培养细胞；d.电转染方法，具体步骤如下
(a)、在步骤c中得到的待转染的培养细胞中加入步骤a中配制的麝香水溶性提取物，使待转染的培养细胞中麝香的终浓度达到0.1-0.5‰，培养2-10小时；(b)、将步骤(a)得到的培养细胞离心分离，转速为1000转/分，时间为3分钟，沉淀细胞重悬于电转化缓冲液中，制成密度为1×107个/mL的细胞悬液；所用的电转化缓冲液为KCl 25mM，KH2PO40.3mM，K2HPO40.85mM，pH 7.2；(c)、将步骤b抽提的质粒DNA加入到细胞悬液中，使细胞悬液中质粒DNA的总浓度为5-20μg/mL，混匀；(d)、将步骤(c)中的细胞悬液移入冰上预冷的100μL电转化杯中，用电转化仪在室温下电击一次，电压为200-250伏特，时间为80-120微秒，电击完毕后，将转化杯置于冰上10分钟；(e)、将电转化杯中的培养细胞转到细胞培养皿中，用基础培养液将被转染的细胞稀释10倍，置于培养箱中，在37℃，5％CO2下培养，观察细胞形态并传代培养。
上述的带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒DNA的抽提方法为将转化有pEGFP-C1质粒的细菌DH5α，在液体培养基中培养16小时，用标准的质粒抽提方法得到质粒DNA，用双蒸水溶解，保存于-20℃备用。
上述的大鼠神经干细胞的分离和培养的方法为无菌条件下取胎龄14天的SD大鼠纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，细胞种植在原代培养液中，浓度为3×105个/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，该细胞为原代培养细胞；原代培养细胞培养一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用移液器将细胞悬液收集到离心管中离心分离，转速为1000转/分，时间为3分钟，弃上清液，然后加入基础培养基，将沉淀细胞悬浮，并转移到无菌的培养瓶内培养。
本发明方法采用低浓度的麝香来提高大鼠神经干细胞电转化效率，可以达到不影响培养细胞生长而提高电转染效率的目的。
具体实施例方式实施例一1.麝香水溶性提取物的制备将0.15g麝香溶解于2g无菌水中，震荡使其充分溶解，离心3分钟(3000转/分，4℃)，取上清液过滤除菌，即为麝香水溶性提取物原液，以麝香对水的重量百分比计，其浓度为7.5％〔(0.15÷2)×100％＝7.5％〕，置于4℃冰箱中保存。使用时根据终浓度用培养基稀释。2、带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒DNA抽提将转化有pEGFP-C1质粒的细菌(DH5α)，在液体培养基中培养16小时，用标准的质粒抽提方法得到质粒DNA，用双蒸水溶解，保存于-20℃备用。
3、大鼠神经干细胞的分离和培养无菌条件下取胎龄14天的SD大鼠纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，细胞种植在原代培养液中，浓度为3×105个/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，该细胞为原代培养细胞。原代培养细胞培养一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用移液器将细胞悬液收集到50mL的离心管中离心(1500转/分，5分钟)，弃上清，然后加入基础培养基，将沉淀细胞悬浮，并转移到无菌的培养瓶内，得到待转染的培养细胞。(基础培养液的组成为DMEM/F12(1∶1，V∶V)，100U/mL的青霉素和链霉素，2％的B27；原代培养液为基础培养液分别加20ng/mL的EGF和bFGF)。
4、电转染方法a、在待转染的培养细胞中加入麝香水溶性提取物原液，使待转染的培养细胞中麝香的终浓度为0.3‰，对照加基础培养液，培养2小时；b、将a培养细胞收集于离心管中离心(1500转/分，5分钟)，沉淀的细胞重悬于电转化缓冲液中(KCl 25mM，KH2PO40.3mM，K2HPO40.85mM，pH 7.2)，制成密度为1×107个/mL的细胞悬液；c、将步骤2中得到的质粒加入到细胞悬液中，使细胞悬液中质粒的浓度为5μg/mL，混匀。
d、将步骤c中的细胞悬液移入冰上预冷的100μL电转化杯中，在室温下将电转化杯放入电转化装置的杯架上，以200伏特，80微秒电击一次；f、电击完毕后，将转化杯置于冰上10分钟；g、将电转化杯中的培养细胞转到细胞培养皿中，用基础培养液将被转染的细胞稀释10倍，置于培养箱中培养(37℃，5％CO2)，观察细胞形态并传代培养。
实施例二不同麝香浓度对电转染率的影响控制待转染的培养细胞中麝香的浓度为0.3‰、1.0‰、3.0‰，以观察不同浓度的麝香对电转染率的影响，结果见表1，表1麝香对电转染效率的影响
电转染率计算方法为电穿孔后48小时，在倒置显微镜下观察计数。在可见光下先固定1个视野，计总细胞数，然后转换荧光光源，计绿色荧光的细胞数，共取5个视野以计算平均值。电转染率＝(绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)×100％。
根据表1的结果，可以得出实验组(加麝香)比对照组的电转染率提高2倍以上。但麝香浓度由0.3‰提高10倍达到3.0‰时，电转染率增加不显著。
实施例三麝香对培养细胞生长的影响采用不同浓度的麝香(0.3‰、1.0‰、3.0‰)对培养的大鼠神经干细胞进行观察，其结果为0.3‰实验组细胞培养24小时形态无明显变化，而1‰实验组仅10小时细胞形态开始出现变化，3‰实验组3小时即开始变化，且细胞形态的变化呈现多样性，主要表现为大量分叉、突起的出现，贴壁细胞数量增加，细胞团大量减少，胞体增大，向不同方向伸出突起，并出现部分两极突起的梭形细胞，周围出现折光性良好的小颗粒，高浓度长时间会造成部分细胞死亡。
实验表明低浓度时，麝香对培养细胞无明显的损伤，而高浓度时会伤害细胞，影响细胞生长。
实施例四麝香损伤细胞的恢复实验对实施例三中受损伤的培养细胞，重新转到正常的基础培养基中，7-15天已基本恢复到原来的神经干细胞形态。表明麝香对细胞的损伤是可逆的。
上述实施例结果表明，用低浓度的麝香可以达到不影响培养细胞生长而提高电转染效率的目的。
权利要求
1.麝香水溶性提取物提高神经干细胞电穿孔转染率的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为a.配制麝香提取物的水溶液；b.带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒pEGFP-C1的DNA抽提；c.大鼠神经干细胞的分离和培养，采用的基础培养液的组成为DMEM/F12的体积比为1∶1，100U/mL的青霉素和链霉素，2％的B27；原代培养液为基础培养液分别加20ng/mL的EGF和bFGF，得到待转染的培养细胞；d.电转染方法，具体步骤如下(a)、在步骤c中得到的待转染的培养细胞中加入步骤a中配制的麝香水溶性提取物，使待转染的培养细胞中麝香的终浓度达到0.1-0.5‰，培养2-10小时；(b)、将步骤(a)得到的培养细胞离心分离，转速为1000转/分，时间为3分钟，沉淀细胞重悬于电转化缓冲液中，制成密度为1×107个/mL的细胞悬液；所用的电转化缓冲液为KCl 25mM，KH2PO40.3mM，K2HPO40.85mM，pH7.2；(c)、将步骤b抽提的质粒DNA加入到细胞悬液中，使细胞悬液中质粒DNA的总浓度为5-20μg/mL，混匀；(d)、将步骤(c)中的细胞悬液移入冰上预冷的100μL电转化杯中，用电转化仪在室温下电击一次，电压为200-250伏特，时间为80-120微秒，电击完毕后，将转化杯置于冰上10分钟；(e)、将电转化杯中的培养细胞转到细胞培养皿中，用基础培养液将被转染的细胞稀释10倍，置于培养箱中，在37℃，5％CO2下培养，观察细胞形态并传代培养。
2.根据权利要求1所述的麝香水溶性提取物提高神经干细胞电穿孔转染率的方法，其特征在于带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒DNA的抽提方法为将转化有pEGFP-C1质粒的细菌DH5α，在液体培养基中培养16小时，用标准的质粒抽提方法得到质粒DNA，用双蒸水溶解，保存于-20℃备用。
3.根据权利要求1所述的麝香水溶性提取物提高神经干细胞电穿孔转染率的方法，其特征在于大鼠神经干细胞的分离和培养的方法为无菌条件下取胎龄14天的SD大鼠纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，细胞种植在原代培养液中，浓度为3×105个/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，该细胞为原代培养细胞；原代培养细胞培养一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用移液器将细胞悬液收集到离心管中离心分离，转速为1000转/分，时间为3分钟，弃上清液，然后加入基础培养基，将沉淀细胞悬浮，并转移到无菌的培养瓶内培养。
全文摘要
本发明涉及一种利用麝香水溶性提取物来提高神经干细胞电转染率的方法。本发明方法包括配制麝香水溶液性提取物、带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的质粒DNA抽提、大鼠神经干细胞的分离和培养、电转染。本发明方法采用低浓度的麝香水溶物来提高大鼠神经干细胞电转化效率，可以达到不影响培养细胞生长而提高电转染效率的目的。
文档编号C12N15/85GK1834234SQ20061002523
公开日2006年9月20日 申请日期2006年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者宋红生, 郭志华, 沈崎, 陈付学, 文铁桥, 李德祥 申请人:上海大学