专利名称：番茄环斑病毒单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种番茄环斑病毒单克隆抗体。
背景技术：
番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)为豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员，病毒粒子为等径二十面体，直径约30nm。基因组含两条正义单链RNA，RNA1编码复制酶，RNA2编码运动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)。
ToRSV广泛分布于欧美及大洋州，能侵染大豆、葡萄、桃、李、苹果、樱桃、番茄及烟草等150多种作物，引起多种病害，严重时导致绝产。ToRSV有多种传播方式，在田间介体剑线虫(Xiphinema)和嫁接传播是ToRSV传播和流行的重要方式，而远距离传播主要靠种子(苗)调运。种子传毒的植物很多，有的种传率很高，如大豆76％、千日红76％、接骨木11％、蒲公英24％、红三叶草3～7％、番茄3％。该病毒是一种高风险的病毒，为我国禁止入境的一类检疫性有害生物。
由于ToRSV是一种可随种子苗木调运进行远距离传播的高风险检疫性有害生物，为防止该病毒进入我国，建立有效的快速检测方法十分重要。目前，国内外针对ToRSV的检疫所使用的手段包括电镜观察、鉴别寄主反应(生物学方法)、血清学试验和分子生物学手段。由于ToRSV是一种直径为28nm的球状病毒，而样品中的病毒含量低，难以在电镜下观察鉴定；接种鉴别寄主则需要专门的隔离温室，花费时间长，更由于病毒的隐症现象而影响了鉴定结果。血清学方法是植物病毒快速检测的必要手段，目前口岸的病毒检测依赖于购置国外的抗血清，价格昂贵，而国内还没有ToRSV血清检测试剂盒用于进境植物种苗的报道。
本发明针对我国大量种苗进口可能携带番茄环斑病毒进境的现状，应用纯化的ToRSV免疫BALB/C小鼠，制备出抗ToRSV单克隆抗体，经效价测定和酶联免疫试验，特异性较好，为进一步研制开发ToRSV血清检测试剂盒奠定了基础。因此，对于检测ToRSV，ToRSV单克隆抗体就显得十分重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种番茄环斑病毒单克隆抗体，其具有与番茄环斑病毒反应的特异性，为进一步研制开发番茄环斑血清检测试剂盒奠定了基础。
为解决上述技术问题，本发明提供一种番茄环斑病毒单克隆抗体，其与番茄环斑病毒特异性结合，并缺乏对其它病毒和植物组织的结合特异性，所述番茄环斑病毒单克隆抗体由如下步骤制得步骤1，番茄环斑病毒提纯；步骤2，用纯化的ToRSV注射免疫BALB/c小鼠(一种近交系小鼠)，取其脾细胞使之与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合；
步骤3，以ToRSV感染的番杏病叶汁液(1∶10-1∶15稀释)包被酶联板，同时以健康番杏叶汁液作阴性对照，取融合细胞培养上清用间接ELISA方法(酶联免疫吸附试验)筛选抗体阳性孔；步骤4，选择强阳性反应孔的杂交瘤细胞，用HT(次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷)培养液培养并做适当浓度的稀释(每孔约0.7个细胞)，选取仅含一个细胞群的孔检测其上清抗体，抗体阳性孔杂交瘤细胞再经过2-3次克隆操作及检测后，得到3株分泌ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞；步骤5，扩增培养并离心收集阳性杂交瘤细胞，腹腔注射BALB/C雌性小鼠，分别制备3株腹水单抗，以A8、B7和G9表示；步骤6，采用饱和硫酸铵盐析法粗提，并经Sephadex G-200(G-200型葡聚糖凝胶)层析柱纯化腹水抗体。用Biophotometer分光光度计(德国)检测A8、B7和G9三者单抗浓度分别约为8.04mg/ml、3.36mg/ml和9.41mg/ml；步骤7，将ToRSV感染的番杏病叶汁液(1∶10-1∶15稀释)包被酶联板，分别加入制备的ToRSV单克隆抗体，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(G型免疫球蛋白)为二抗，经TMB(四甲基联苯胺)显色，该3株单克隆抗体腹水效价在10-5～10-6之间。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明具有以下有益效果本发明ToRSV单克隆抗体经效价测定和酶联免疫试验，结果表明ToRSV单抗具有与ToRSV反应的特异性，可作为ToRSV检测的重要材料，为进一步研制ToRSV血清检测试剂盒奠定了良好的基础。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例1 ToRSV提纯1材料1.1 ToRSV毒源本次试验所用的ToRSV毒源有2个分离物ToRSV毒源1(以ToRSV-1表示)上海出入境检验检疫局植检实验室保存的毒源。
ToRSV毒源2(以ToRSV-2表示)中国检验检疫科学研究院动植物检疫实验所病毒检测中心惠赠。
1.2繁殖植物本次试验所用的ToRSV的繁殖植物番杏(Tetragonia expansa)，购自北京陆桥中国检验检疫公司。
2方法2.1植物病毒的纯化
2.1.1接种植物的准备取经121℃蒸汽消毒1小时的营养土装入育苗盆中，播入番杏种子，轻轻覆土，等到苗长出2～3片真叶时，作为接种材料。
2.1.2病毒接种将冷冻保存的ToRSV毒源0.5g置于研钵，加入适量接种缓冲液，充分研磨；将少许硅藻土撒至待接种番杏叶片的表面；用手指蘸取少许研磨液，均匀涂抹于叶表，在同一处重复摩擦2～3次，并用清水冲洗接种过的叶片，接种后的植株放于22～25℃温室进行培养，接种后7～14天植株显症明显后，采集全株(除根外)用作病毒的提纯。
2.1.3 ELISA鉴定称取带毒番杏叶片100mg加磷酸缓冲液充分研磨，将研磨所得汁液3000r/min离心5min以去除残渣，取病汁液上清进行双抗体夹心(DAS)-ELISA检测，碱性磷酸酶标记的ToRSV多克隆抗体购自Agdia公司。
2.1.4病毒提纯选用-70℃保存的接种ToRSV的番杏1000g，按1g叶片加2ml 0.05MPB(pH7.0，含0.2％巯基乙醇)，全部置组织捣碎机里捣碎，尼龙纱过滤，滤液低速离心，8000r/min离心15min；上清液加1％TritonX-100(V/W)澄清，低速离心，8000r/min离心15min；上清液加质量浓度为8％PEG(Mr6000)，3％NaCl，置4℃冰箱悬浮搅拌4h，8000gr/min离心30min；沉淀以0.01M PB(含0.002M EDTA)悬浮，置4℃冰箱悬浮搅拌4h或过夜，9000r/min离心15min；将收集的上清液30000r/min离心3h；沉淀悬浮于去离子水中，7000gr/min离心20min，上清液即为病毒粗提液；将上述病毒粗提液经25％甘油垫超速离心，即得提纯病毒。
实施例2动物免疫与细胞融合a、主要材料及试剂纯化ToRSV样品由上海市出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心制备保存并提供，见实施例1。BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心，昆明种小鼠购自上海海军医学研究所实验动物中心。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由第二军医大学微生物学教研室保存并提供。HAT及HT培养基购自上海美著生物技术有限公司。
b、动物免疫与细胞融合用纯化的ToRSV首次加等体积弗氏完全佐剂注射免疫BALB/c小鼠，随后用ToRSV加体积弗氏不完全佐剂注射免疫小鼠，共注射免疫6次。用ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体滴度，筛选ToRSV免疫阳性小鼠。最后一次加强免疫后3天取小鼠脾脏，制备脾细胞，用RPMI-1640培养基洗涤3次，除去脂肪和碎片，并用RPMI-1640配成每ml含1×106-2×106个单个核细胞。收集培养的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，将脾细胞与SP2/0细胞按5∶1-10∶1的比例混合于锥型塑料离心管中，加入30ml无血清基础培养液，1500rpm(每分钟转数)离心5min后弃上清，将离心管放入37℃水浴。在1min内滴加已预热至37℃的50％pH约为8.0的PEG(聚乙二醇)(分子量3350)0.5ml，并充分混合均匀，静置1min，再沿管壁四周轻轻加入无血清培养液，前30秒内加1ml，后30秒内加3ml，然后再加入26ml无血清培养液，1500rpm离心5min。弃去上清，用适量HAT(次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶苷)培养基悬浮沉淀，将悬液移入细胞培养瓶内，最后再分装入预先培养有滋养细胞的96孔培养板，然后在5％CO2(二氧化碳)37℃细胞培养箱中培养10-14天，中间替换新的HAT和HT培养液各一次(第3天和第7天)，当细胞生长至合适大小(约1/4孔底面积)时，检测培养上清是否有特异性抗体的产生。
实施例3杂交瘤细胞筛选和克隆以ToRSV感染的番杏病叶汁液(1∶10-1∶15稀释)包被ELISA条形孔，同时以健康番杏叶汁液作阴性对照，取细胞培养上清用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔。选择强阳性反应孔的杂交瘤细胞，用HT培养液吹打混匀后，吸出部分细胞，并做适当浓度的稀释(每孔约0.7个细胞)，再分别加入到96孔细胞板中培养，选取仅含一个细胞群的孔检测其上清抗体。抗体阳性孔杂交瘤细胞再经过2-3次克隆操作及检测后，即可得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
实施例4腹水抗体制备1500rpm离心收集对数生长期的杂交瘤细胞，悬浮于生理盐水中，加适量青霉素和链霉素，悬浮细胞浓度为106个/ml。取8周龄健康BALB/C雌性小鼠，腹腔注射0.2-0.5ml降植烷，7天后在腹腔内注射0.5ml杂交瘤细胞悬液。注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，用大号针头刺入鼠腹部，收集腹水，1500rpm离心10min，收集上清液即为腹水单克隆抗体，加入0.01％叠氮钠(NaN3)，分装小瓶，-20℃冻存待用，ELISA法测定腹水效价。
实施例5腹水抗体的纯化及效价测定采用饱和硫酸铵盐析法粗提。2ml腹水抗体用饱和硫酸铵沉淀后，将所得沉淀用PBS(磷酸盐缓冲液)溶解，然后将溶液加至Sephadex G-200层析柱层析，再用0.01M PBS缓冲液洗脱单抗IgG，即得纯化的腹水抗体。将纯化的腹水抗体按1∶10稀释后用Biophotometer分光光度计检测A280紫外吸收值，测定抗体浓度。将ToRSV感染的番杏病叶汁液(1∶10-1∶15稀释)包被酶联板，将单克隆抗体进行一系列的倍比稀释后，以间接ELISA测定抗体的效价。
实施例6间接ELISA将ToRSV感染的番杏病叶用包被液在研钵内研磨后，1∶10-1∶15稀释后，加至酶标板，每孔100μl，置37℃温育2～3h后，加10％BSA封闭液125μl，37℃温育0.5h。弃封闭液，加ToRSV单克隆抗体(1∶1000-1∶2000稀释)100μl，37℃温育1.5h，PBST洗涤三次。随后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 100μl，37℃温育1.5h，PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。最后经TMB显色，测定每孔450nm OD(光密度值)值。每个样品设二个重复，设阳性对照和阴性对照，重复2次。以待测值/阴性对照值＞2.0作为阳性判断标准。
实验结果如下a.杂交瘤细胞的融合、筛选及克隆用纯化ToRSV免疫的BAL B/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1-10∶1的比例在50％PEG下融合，用HAT培养基筛选。融合10天后换用HT培养基，当每孔杂交瘤细胞覆盖孔底10％-50％时，采用间接ELISA方法检测细胞培养上清抗体分泌情况。选择1个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法克隆，最后获得3株(A8、B7和G9)能分泌ToRSV特异性抗体的杂交瘤细胞株。经多次体外传代和冻存复苏后，该3株细胞均能良好生长，并稳定分泌抗体。
b.腹水抗体制备及效价测定小鼠腹腔注射0.2-0.5ml降植烷7d后，腹腔内注射0.5ml杂交瘤细胞悬液。7-10天后采集ToRSV单抗腹水。用ELISA分别测定3株单抗腹水的效价均在10-5-10-6之间。ToRSV单抗腹水经浓缩、透析后，经Biophotometer分光光度计检测，3株ToRSV单抗(A8、B7和G9)浓度分别约为8.04mg/ml、3.36mg/ml和9.41mg/ml。
c.间接ELISA检测将ToRSV感染的番杏病叶汁液(1∶10-1∶15稀释)直接包被酶联板，加入ToRSV单抗(1∶1000-1∶2000稀释)，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗并加TMB显色，同时以健康番杏病叶汁液作为对照，结果表明所制备的3株ToRSV单抗均只与ToRSV感染的番杏叶汁液呈阳性反应，而与健康番杏叶汁液呈阴性反应，表明所制备的ToRSV单抗具有与ToRSV反应的特异性，可作为ToRSV检测的重要材料，为进一步研制ToRSV血清检测试剂盒奠定了良好的基础。
权利要求
1.一种番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，其与番茄环斑病毒特异性结合，并缺乏对其它病毒和植物组织的结合特异性，所述番茄环斑病毒单克隆抗体由如下步骤制得步骤1，番茄环斑病毒提纯；步骤2，用纯化的番茄环斑病毒注射免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞使之与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；步骤3，以番茄环斑感染的番杏病叶汁液包被酶联板，同时以健康番杏叶汁液作阴性对照，取融合细胞培养上清，用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔；步骤4，选择强阳性反应孔的杂交瘤细胞，用HT培养液培养并做适当浓度的稀释，选取孔检测其上清抗体，抗体阳性孔杂交瘤细胞再经过克隆操作及检测后，得到分泌番茄环斑单克隆抗体的杂交瘤细胞；步骤5，扩增培养并离心收集阳性杂交瘤细胞，腹腔注射BALB/C雌性小鼠，分别制备腹水单抗；步骤6，粗提，并经层析柱纯化腹水抗体；步骤7，将番茄环斑感染的番杏病叶汁液包被酶联板，分别加入制备的番茄环斑单克隆抗体，测定所述腹水抗体的效价。
2.如权利要求1所述的番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，步骤4中所述的适当浓度的稀释，该浓度为每孔约0.7个细胞。
3.如权利要求1所述的番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，步骤4中所述的克隆操作是2-3次，所述的分泌番茄环斑单克隆抗体的杂交瘤细胞是3株。
4.如权利要求1所述的番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，步骤4中所述的选取孔检测其上清抗体，该孔是仅含一个细胞群的孔。
5.如权利要求1所述的番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，步骤6中所述的粗提采用饱和硫酸铵盐析法。
6.如权利要求1所述的番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，步骤7中所述的腹水抗体的效价测定采用间接ELISA法，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗。
7.如权利要求1所述的番茄环斑病毒单克隆抗体，其特征在于，步骤3或步骤7所述的番茄环斑感染的番杏病叶汁液经过1∶10-1∶15稀释。
全文摘要
本发明公开了一种番茄环斑病毒单克隆抗体，其与番茄环斑病毒特异性结合，并缺乏对其它病毒和植物组织的结合特异性，其制备方法包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和克隆等步骤。应用纯化的番茄环斑病毒免疫BALB/c小鼠，制备出番茄环斑病毒单克隆抗体，经效价测定和酶联免疫试验，特异性较好，为进一步研制开发番茄环斑血清检测试剂盒奠定了基础。
文档编号C12N15/09GK101041695SQ200610024888
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月21日 优先权日2006年3月21日
发明者杨翠云, 曹洁, 于翠, 郑建中, 沈禹飞, 陶庭典, 代光辉 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局, 上海交通大学, 中国人民解放军第二军医大学