专利名称：乳品中结核分枝杆菌的pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种乳品中结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR检测方法。
背景技术：
结核病是由人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌所引起，这些病原统称为结核分枝杆菌复合物(或群)。到目前为止，结核病除了感染人外，还能感染50多种哺乳动物和20多种禽类。牛是最敏感的动物，牛结核主要由牛分枝杆菌引起。牛与人类关系密切，人结核有10％以上是由牛分枝杆菌引起。因此发达国家对结核病的防治非常重视，美国是世界上第一个基本消除结核病的国家，欧洲的丹麦、比利时、德国等国家也已基本消灭了牛结核，英国和法国处在控制状态。
20世纪80年代以来结核病在全球范围内的流行呈急剧回升之势，每年约有1000万新发病人，300万死亡，是单因素所致的感染性疾病中病死率最高者之一。中国是世界上第二大结核病病情严重的国家。据卫生部公布的数据，中国目前有肺结核病人约450万，其中传染性肺结核病人约150万，结核病患者数量居世界第二位。中国每年约有145万新发病例，是全球22个结核病高负担国家之一，每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。感染过结核菌而未发病者，更多达5.5亿人，占全国人口的45％。有关专家预计在今后10年，如果不采取适当措施，预计全国将新增结核病患者2000万至3000万人。这将严重威胁广大人民群众的身体健康，给国家和社会带来沉重负担，严重制约中国经济和社会的发展。结核病是一个古老的人畜共患疾病，但社会的发展赋予其流行一些新的特点。随着牛奶在居民正常饮食中的比重逐渐加大，人的结核病发病率也在上升，社会流行病学研究显示二者呈明显的流行病学相关性。
因此，加强食品安全是强化公共卫生预防体系中首要的工作，但长期以来中国乳制品质量标准体系不健全。现行原奶的标准非常低，目前中国的一级奶标准在多数国家都判定为不能作为液态奶的原料，乳品中结核菌检测尚没有行之有效的手段。
基因诊断技术与其他诊断方法相比具有以下突出的优点1，能从基因水平彻底揭示疾病病原2，能显著缩短诊断的时间3，无需对组织、器官或细胞进行选择4，快速准确、安全可靠，因此在临床诊断领域已是一项应用广泛的成熟技术，但在乳品食品安全领域尚未应用。
自SARS、禽流感疫情大面积爆发以来，PCR检测技术迅速成为或正在成为各级疾病预防控制中心主要的检测技术平台之一。牛结核病的早期诊断具有重要的公共卫生意义，它可加强食品安全、最大限度地减少人结核病的新发病例数量，提高社会经济效益。
牛结核病可根据牛群的具体情况采用不同的方法诊断。目前，病牛群以临床和实验室诊断为主，可疑牛群和健康牛群以结核菌素检验为主，配合应用实验室诊断。目前国内外用于诊断牛结核病的检测方法，大体上可分为三大类。第一类是细菌学检查法，如涂片镜检、细菌培养等。结核菌需要的培养时间长，灵敏度低，已不能满足现代临床诊断的需要。第二类是分子生物学方法，如PCR、基于TaqMan技术的实时荧光PCR、DNA图谱等方法，这类方法灵敏度高，特异性好，但目前的常规PCR方法一般只能检测到100mg的PCR扩增产物。Fabrizio Vitale等(1998年)，建立了活牛结核诊断的PCR检测技术，检测皮内反应阴性和皮内反应阳性的动物。巢式PCR扩增获得IS6110插入序列内的182bp的靶序列，该片段克隆并测序，标记以后用于斑点杂交分析。从100头活牛的不同标本来源(包括淋巴结吸出物、乳和鼻拭子)中提取结核分枝杆菌复合群DNA并PCR检测；从60头皮内反应阳性的动物屠宰以后检查，并从淋巴结、肺和乳房组织标本中提取DNA作PCR检测，检测结果全部阳性。以PCR检测屠宰动物的组织标本作为标准，计算的对乳液、淋巴结样本的PCR检测灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值都是100％，而鼻拭子标本的分别是58，100，，00，and 28％。所有检测样本的PCR检测灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是74，100，100，and35％。对皮内反应阴性动物的淋巴结吸出物、乳和鼻拭子的PCR检测分析显示，52％的皮内反应阴性结果是假阴性。
Srinand Sreevatsan等(2000年)开发了多重PCR扩增检测平台，同时检测牛乳和鼻分泌物标本中的牛分枝杆菌和流产布鲁氏菌。该系统包括双重扩增种特定的靶序列(流产布鲁氏菌BCSP31K基因区和牛分枝杆菌hsp65基因的重复序列区)，然后通过固相探针捕获杂交扩增产物的方法检测。在针刺接种正常乳样的试验中，检测灵敏度对流产布鲁氏菌是800CFU当量/ml，对牛分枝杆菌是4CFU当量/ml。
Malcolm James Taylor等在2001年首次报道了使用lightcycler实时荧光PCR检测组织中牛分枝杆菌的技术。检测了38头有结核体征的病牛，采用核酸序列捕获的抽提方法从淋巴结标本中提取牛分枝杆菌DNA，产物检测使用实时荧光PCR和常规PCR，结果与培养和组织病理学分析的结果对照。常规PCR方法在大约9小时内完成，在28头培养阳性的病牛中可以检测出26头(检出率93％)，实时荧光PCR的方法在30min内完成，可以检测出28头中的20头(检出率71％)。实时荧光PCR检测分枝杆菌复合群的特异性通过使用SYBR Green 1和一条结核分枝杆菌复合群特异的Cy5标记荧光共振能量转移探针来保证。
Janin Stratmann等(2002年)首次报道了噬菌体显示技术在微生物诊断中的应用。将噬菌体显示技术和多肽媒介的免疫磁珠分离相结合，开发了一种从自然感染副结核病的奶牛群的乳样本中选择性分离副结核分枝杆菌属鸟型分枝杆菌种的技术。从编码随机12-mer多肽的商业化噬菌体多肽文库中分离出9个特异性结合副结核分枝杆菌属的重组噬菌体。从这9种噬菌体中再筛选出对副结核分枝杆菌属结合能力强、特异性高的噬菌体Fmp3，Fmp3核苷测序，由核苷序列推导的多肽序列为NYVIHDVPRHPA，化学合成多肽，其氨基端通过6碳氨基酸分子连接生物素残基，该多肽序列记为AMP3。免疫磁珠表面覆盖FMP3或AMP3之后可以从乳液中捕获副结核分枝杆菌分子，以插入序列ISMav2为扩增靶序列的PCR结果显示这种方法在人工针刺模拟的临床乳样本中检测灵敏度可以达到10个菌/ml。
第三类是免疫学方法，如皮内变态反应、ELISA等方法。到目前为止，世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病诊断方法只有结核菌素(PPD)变态反应。但该方法存在很多弊端，除物理和化学的因素外，更多的是非典型分枝杆菌的干扰，常造成非特异性反应的发生。这是因为PPD虽称为纯化蛋白衍生物，但其实际上是包含有多种抗原成分的混合物，不能鉴别TB感染，鸟型分枝杆菌致敏及BCG免疫产生的DTH应答。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种灵敏度更高，便于早期检测乳品中结核分枝杆菌的方法。
本发明提供了一种乳品中结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR检测方法。本发明方法的建立基于TaqMan技术的实时荧光PCR检测，检测的靶序列为引起人和动物结核病的结核分枝杆菌复合群(包括四种结核分枝杆菌)所特有，特异性引物和特异性探针对包括土地、不产色、施氏、次要分枝杆菌在内的20多种非致病性分枝杆菌和包括禽型、胞内、蟾蜍、堪萨斯在内的十多种致病性分枝杆菌没有S型实时荧光PCR扩增曲线，其扩增曲线为一条水平线。基于TaqMan技术的实时荧光(real-time)PCR检测，关键是在普通PCR的一对特异性引物基础上增加了一条特异性的荧光双标记探针，该探针同样与病原体核酸特异性结合，而且结合部位位于引物结合区域的中间。由于荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，检测灵敏度较常规PCR电泳检测方法有突破性提高，常规PCR方法一般能检测到100ng的PCR扩增产物，而荧光PCR能检测到0.1ng的PCR扩增产物；而且荧光PCR通过已知浓度的标准品作为PCR扩增反应的模板，比较标准品与检测标本的Ct值，可以实现对病原体核酸的定量。
本发明的乳品中结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR检测方法经过试验检测结果如下1、材料和方法1.1菌株冻干粉卡介苗由上海市疾病预防控制中心提供，-20℃保存，按国家冻干皮内注射用卡介苗制造及检定规程规定冻干菌苗菌数应在100万/mg以上，本发明使用的卡介苗每安瓿瓶5人份，含卡介菌0.2-0.3mg，菌数应在20万以上。卡介苗加1ml双蒸水溶解，溶解以后的菌液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000的稀释。
1.2模拟临床乳样本为检测样本采用50ul梯度浓度的稀释菌液混入450ul乳液中，乳液使用市售超高温灭菌纯牛奶，各检测样本为溶液A500ul乳液中包含50ul的1∶10稀释的卡介苗菌液，50ul菌液含菌数1000以上，终浓度1000个菌/0.5ml以上，溶液B500ul乳液，卡介苗终浓度100个菌/0.5ml以上，溶液C500ul乳液，卡介苗终浓度10个菌/0.5ml以上，溶液D500ul乳液，卡介苗终浓度1个菌/0.5ml以上。
1.3引物、探针设计根据GenBank中分枝杆菌编码16sRNA基因和23sRNA基因之间ITS(internaltranscribed spacer)序列，使用OMIGA软件作序列比较后，使用OLIGO6.0，PRIMER5.0，BEACON软件设计一对特异性引物和特异性探针，PCR扩增产物为结核分枝杆菌复合群所特有。引物、探针由上海生工公司合成。
1.4菌株DNA提取对于不同梯度浓度的卡介苗稀释菌液，50ul稀释菌液直接加本发明人生产的结核分枝杆菌(TB)DNA提取液，100℃15分钟，13000rpm 2分钟，即可用来作PCR扩增。因为稀释菌液成分简单，直接用TB提取液裂解TB细胞并收获，可以相当真实地反映稀释菌液中的含菌数量。
对牛奶中卡介苗(牛分枝杆菌)的DNA提取，选用本发明人开发的固相柱法提取试剂，其结构包括有Silica材料固定在管底的内制备管以及套在内制备管上的外离心管。因为牛乳的包含乳脂、乳蛋白等多种复杂成分，普通提取试剂不适于这种复杂样本的处理。基于Silica材料的固相提取技术的主要原理是样本在高离溶液中裂解释放核酸，然后结合到Silica材料上，经过清洗去除细胞碎片、蛋白或血红素(临床样本中)等杂质，然后在低离子强度下核酸从Silica材料上解离释放到洗脱液中，具体操作步骤是(1)在1980ul LB裂解缓冲液中加入20μl Poly(A)多聚腺嘌呤，混匀后使用。
(2)在装有500μl样本的1.5ml离心管中加入500μl预混有Poly(A)的LB，振荡混匀，72℃保温裂解25min。
(3)在上述保温后的溶液中加入200μl异丙醇，振荡混匀后转移600ul溶液到柱式制备/离心管中，10,000rpm离心1min后弃滤液。
(4)将剩余的600ul溶液转移到柱式制备/离心管中，10,000rpm离心1min后弃滤液。
(5)在制备管中加入WB洗脱缓冲液500μl，10,000rpm离心1min后弃管底部离心滤液。
(6)13,000rpm离心1min以彻底去除残余的WB洗脱缓冲液，然后将制备管放置在一新的洁净离心管中，加入预先预热到72℃的EB 50μl，室温放置2min。
(7)10,000rpm离心1min收集管底的离心滤液，即为从样本中分离的核酸洗脱溶液，若为DNA需保存在-20℃、RNA则保存在-70℃冰箱。
1.5实时荧光PCR反应在50ul的反应体系中，加入7ul提取产物作模板，加混有引物的实时荧光PCR反应缓冲液30ul，加MgCl25ul，加荧光探针5ul，加混有UNG酶的Taq酶3ul，UNG酶可有效消除PCR扩增产物污染对实验的影响。在BioRad公司的icycler荧光PCR扩增仪的反应条件为50℃2min；94℃5min；93℃30sec，60℃1min，40个循环。
在本发明方法中所述裂解缓冲液和洗脱缓冲液均是常规使用的缓冲液，可以市售得到。
2、结果2.1卡介苗稀释菌液的荧光PCR检测结果5人份卡介苗加1ml双蒸水溶解，溶解以后的菌液再作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000的稀释；各梯度浓度随机取50ul菌液3支，记为样本1、样本2和样本3，加50ulTB DNA提取液提取，在BioRad公司的icycler荧光PCR扩增仪上反应。实时荧光PCR检测结果(Ct值)见表1，荧光阈值25。
表1 卡介苗稀释菌液荧光PCR检测结果(Ct值)
2.2模拟临床乳样本的荧光PCR检测结果模拟临床乳样本按前述方法配制，包括溶液A，溶液B，溶液C和溶液D四种卡介苗菌梯度浓度的样本，各浓度样本都作3份检测，记为样本1、2、3。使用固相柱法试剂提取分枝杆菌DNA，在BioRad公司的icycler荧光PCR扩增仪上反应。实时荧光PCR扩增结果(Ct值)见表2，卡介苗稀释菌液与模拟临床乳样本的实时荧光PCR检测在同一次试验中完成，荧光阈值25。
表2 模拟临床乳样本荧光PCR检测结果(Ct值)
从表2看出，即使是溶液D(500ul乳液中包含50ul的1∶10000稀释的卡介苗菌液，50ul菌液含菌数1以上，终浓度1个菌/0.5ml以上)，固相柱法提取之后，三个样本中仅有一个没有检测到。以后，为了反复验证该实验结果，在不同时间重复实验。1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000稀释的卡介苗菌液，理论上分别与溶液A、溶液B、溶液C、溶液D的含菌量相同，但实际上两者检测样本不同，卡介苗菌加双蒸水稀释的菌液简单而且不存在抑制PCR扩增成分，模拟临床乳样本复杂并存在抑制PCR扩增成分；检测方法也不同，用于处理临床乳样本的固相柱法试剂在使用的过程中，由于多次洗脱引起的DNA损失以及硅基质吸附的DNA不能完全洗脱引起的损失降低了最终的DNA收获效率，因此反映在两者的浓度比较上，模拟临床乳样本的Ct值要滞后于卡介苗稀释菌液的Ct值。
2.3模拟临床乳样本的重复试验完成两次重复实验。第一次，对菌浓度低的溶液C、溶液D重复实验，荧光PCR扩增前5个样本为溶液C的扩增体系，Ct值分别为31.0、31.2、31.5、31.2、31.7，后5个样本为溶液D的扩增体系，Ct值分别为34.5、33.7、34.0、34.1、35.0。
第二次，对溶液A、溶液B、溶液C和溶液D重复实验，各浓度作4个检测样本，分别记为样本1、2、3、4，在荧光PCR扩增时每个样本作1个复管，实时荧光PCR检测结果见表3。从表3可知，8个溶液D的检测样本全部检测到，灵敏度达到100％。
表3 第二次重复试验的荧光PCR扩增结果(Ct值)
分析表3结果，我们发现在较高浓度的溶液A、B、C，各实验结果重复性很好，Ct值接近，而在很低浓度的溶液D，由于本身含菌量很少，Ct值之间有一定差异，上表结果与之前实验结果比较，相同浓度的样本之间Ct值接近，说明实验结果重复性好。
上述结果表明本发明方法在临床应用之后，可以在丝毫不影响牛群正常生产的前提下，达到牛结核病监测和早期检测的目的，符合现代乳业的奶牛及奶制品安全生产的需要。
本发明方法灵敏度高，特异性好，还具有以下特点第一，操作简单、快速，分枝杆菌DNA提取和实时荧光PCR过程在3-4个小时内完成，符合现代临床诊断技术的需要。第二，取样方便，取奶牛乳液进行检测，未对奶牛造成侵入性伤害或应激反应。第三，应用广泛，除用于牛结核病诊断外，检测乳中结核分枝杆菌具有重要的食品安全意义，由于具备早期诊断的特点，有较好的推广应用价值。
具体实施例方式例1 临床牛乳样本的荧光PCR检测结果将10例临床牛乳结核阳性标本采用固相柱法试剂提取分枝杆菌DNA，在BioRad公司的icycler荧光PCR扩增仪上反应。实时荧光PCR扩增结果详见表4，荧光阈值为25。
表4 临床样本荧光PCR扩增结果(Ct值)
从表4看出，10例临床阳性样本中有1例没有被检出，但这1例未检出样本可能是因为样本中菌数比较少，如同模拟临床乳样本低浓度一样，处理临床乳样本的固相柱法试剂在使用的过程中，由于多次洗脱引起的DNA损失以及硅基质吸附的DNA，不能完成洗脱引起的损失降低了最终的DNA收获效率，从而导致假阴性结果。
例2 临床牛乳阳性样本的荧光PCR检测特异性实验结果采用乙肝病毒DNA，沙门氏菌DNA，志贺氏菌DNA，大肠杆菌DNA以及人乳头瘤病毒DNA等各种临床阳性标本提取物进行特异性实验(浓度皆大于104copies/μL)，均无扩增信号，与阴性对照结果相同，仅临床牛乳阳性标本DNA有扩增信号。
表5.临床阳性样本的特异性实验结果
例3 临床牛乳结核阳性样本采用不同PCR扩增仪检测的结果采用临床牛乳结核阳性标本通过对该检测技术进行优化(包括反应体系和反应程序的优化)，并在不同荧光PCR扩增仪(PE5700、PE7000、Lightcyler、iCycle、SLAN等荧光PCR扩增仪)上扩增，扩增结果的Ct值见表6。
表6.临床阳性样本的不同PCR扩增仪实验结果(Ct值)
。
权利要求
1.一种乳品中结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR检测方法其特征在于该方法包括下列步骤(1)材料和方法菌株冻干粉卡介苗由上海市疾病预防控制中心提供，-20℃保存，按国家冻干皮内注射用卡介苗制造及检定规程规定冻干菌苗菌数应在100万/mg以上，本发明使用的卡介苗每安瓿瓶5人份，含卡介菌0.2-0.3mg，菌数应在20万以上，卡介苗加1ml双蒸水溶解，溶解以后的菌液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000的稀释；模拟临床乳样本为检测样本采用50ul梯度浓度的稀释菌液混入450ul乳液中，乳液使用市售超高温灭菌纯牛奶，各检测样本为溶液A500ul乳液中包含50ul的1∶10稀释的卡介苗菌液，50ul菌液含菌数1000以上，终浓度1000个菌/0.5ml以上，溶液B500ul乳液，卡介苗终浓度100个菌/0.5ml以上，溶液C500ul乳液，卡介苗终浓度10个菌/0.5ml以上，溶液D500ul乳液，卡介苗终浓度1个菌/0.5ml以上；引物、探针设计根据GenBank中分枝杆菌编码16sRNA基因和23sRNA基因之间ITS(internaltranscribed spacer)序列，使用OMIGA软件作序列比较后，使用OLIGO6.0，PRIMER5.0，BEACON软件设计一对特异性引物和特异性探针，PCR扩增产物为结核分枝杆菌复合群所特有，引物、探针由上海生工公司合成；菌株DNA提取对于不同梯度浓度的卡介苗稀释菌液，50ul稀释菌液直接加自产的结核分枝杆菌DNA提取液，100℃15分钟，13000rpm 2分钟，即可用来作PCR扩增；实时荧光PCR反应在50ul的反应体系中，加入7ul提取产物作模板，加混有引物的实时荧光PCR反应缓冲液30ul，加MgCl25ul，加荧光探针5ul，加混有UNG酶的Taq酶3ul，UNG酶可有效消除PCR扩增产物污染对实验的影响，在BioRad公司的icycler荧光PCR扩增仪的反应条件为50℃2min；94℃5min； 93℃30sec，60℃1min，40个循环。
2.根据权利要求1所述的一种乳品中结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR检测方法，其特征在于其中所述步骤(1)中的菌株提取方法包括下列步骤(1)在1980ul裂解缓冲液中加入20μl多聚腺嘌呤，混匀后使用；(2)在装有500μl样本的1.5ml离心管中加入500μl预混有多聚腺嘌呤的裂解缓冲液，振荡混匀，72℃保温裂解25min；(3)在上述保温后的溶液中加入200μl异丙醇，振荡混匀后转移600ul溶液到柱式制备/离心管中，10,000rpm离心1min后弃滤液；(4)将剩余的600ul溶液转移到柱式制备/离心管中，10,000rpm离心1min后弃滤液；(5)在制备管中加入洗脱缓冲液500μl，10,000rpm离心1min后弃管底部离心滤液；(6)13,000rpm离心1min以彻底去除残余的洗脱缓冲液，然后将制备管放置在一新的洁净离心管中，加入预先预热到72℃的洗冲缓冲液50μl，室温放置2min；(7)10,000rpm离心1min收集管底的离心滤液，即为从样本中分离的核酸洗脱溶液，若为DNA需保存在-20℃、RNA则保存在-70℃冰箱。
全文摘要
本发明公开了一种实时荧光PCR检测乳品中结核分枝杆菌复合群的方法，为乳品生产中结核菌检测提供了有效手段，具有检测灵敏度高、特异性强的优点，用于奶牛结核的早期诊断克服了以往牛结核PCR检测取样难的缺陷。以乳液中加卡介苗作为模拟临床检测样本，对DNA提取方法进行改进，利用基于TaqMan技术的实时荧光PCR检测，选择分枝杆菌编码16sRNA基因和23sRNA基因之间ITS序列作为扩增靶序列。本发明的实时荧光PCR检测达到每毫升乳液检测10个结核分枝杆菌的灵敏度。本发明方法在乳品安全检测、公共卫生预防体系中的人畜共患结核病防治、奶牛结核病诊断等领域有重要应用价值。
文档编号C12Q1/25GK101029335SQ20061002423
公开日2007年9月5日 申请日期2006年2月28日 优先权日2006年2月28日
发明者杜明韬, 戴文浦 申请人:上海海登姆生物科技有限公司