专利名称：无血清动物细胞培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域，是一种不存在动物源物质血清情况下，生产下游产品的无血清动物细胞培养基制备方法。
背景技术：
无血清培养基是一种不需要动物血清的人工合成培养基，它可避免动物血清在细胞培养过程中带来的污染和血清中不明成分对培养结果造成不确定影响。中国专利申请号2004100184938公开了一种无血清动物细胞培养基，该专利公开的技术成品为粉末型便于运输，特别为配合有血清下游产品衔接操作而设计的方法，但是，其存在着血清与培养基双成本；血清对环境污染大，后续处理成本高；使用血清后对培养结果产生一定概率的不确定因素的缺陷，因此必须进行改进，最好的办法是避免使用血清，而本专利方法可使生产无血清培养基时减低成本便于操作，从而使得在低成本代价下产生高效益。以满足有关部门的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种无血清动物细胞培养基及其制备方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足有关部门的需要。
本发明的无血清动物细胞培养基，由A部分和B部分组成，以无血清动物细胞培养基的总重量为基准，A部分和B部分的组分和重量份数包括A部分基础培养基1000份丙酮酸钠 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸锌·7H2O 0.1732份维生素C 0.01132份硫酸亚铁·7H2O 0.26份柠檬酸三钠 0.26份维生素B120.272份次黄嘌呤 0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-门冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.3份L-丝氨酸 2.1份L-门冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A1份痕量元素B1份痕量元素C1份痕量元素D1份维生素E 0.02份胆固醇 0.04份盐酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐温80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺 120份。
所说的基础培养基选自上海旭太生物工程有限公司产的MEM(α)或GlasgowMEM(上海旭太生物工程有限公司产的MEM(G))；MEM(α)的组成和制备方法在文献stanners，N.P；Eliceiri，G.L；Green，HNature New Biology 230 52-54(1971)中已经有公开的报道，可采用市售产品，如上海旭太生物工程有限公司旭字牌MEM(α)的产品；GlasgowMEM的组成和制备方法在House，WMedical ResearchCouncil，Institute of Visology University of Glasgow Scotland November1964文献中已经有公开的报道，可采用市售产品，如上海旭太生物工程有限公司牌号为MEM(G)的产品；所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；生物素选自市售D生物素。
优选的A部分和B部分的组分和重量份数包括A部分基础培养基 1000份丙酮酸钠 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸锌·7H2O 0.1732份维生素C 0.01132份硫酸亚铁·7H2O 0.26份柠檬酸三钠 0.26份维生素B120.272份次黄嘌呤 0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-门冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.3份L-丝氨酸 2.1份L-门冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A1份痕量元素B1份痕量元素C1份痕量元素D1份维生素E 0.02份胆固醇 0.04份盐酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐温80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺120份。
本发明的无血清动物细胞培养基的制备方法，包括如下步骤a.按照比例，将A部分的原料在60～80℃下真空干燥18～30小时；B部分的原料在30～50℃真空干燥18～30小时；b.将干燥后的A部分原料球磨2～4小时，然后过30～50目筛成为固态粉末状中间体；c.将B部分原料与A部分原料混合，球磨2～4小时，可采用市售双头2缸球磨机，然后过30～50目筛，获得产品。
本发明的无血清动物细胞培养基可以用于动物细胞的培养，优选的动物细胞为BHK21细胞或Vero细胞，所说的BHK21细胞为一种细胞是制造口蹄疫疫苗的重要细胞株，农业部第336号公告(2004年)，猪口蹄疫O型灭活疫苗质量标准为“O型口蹄疫疫猪源病毒需接种在BHK-21细胞之中。可采用市售产品，如中国科学院细胞库提供的产品，所说的Vero细胞为一种绿猴肾细胞，可采用市售产品，如中国科学院细胞库公司提供的产品。
本发明的无血清动物细胞培养基用于动物细胞的培养时，培养基方法如下一例按比例配成重量浓度为1.1～1.36％的水溶液；将原有有血清培养细胞换上不含小牛血清的无血清培液洗涤1～2次，加入不含小牛血清的培液，培养2～3天(此时可接种病毒)，倒出培液；再加不含小牛血清的无血清培液，继续培养2～3天，此时细胞培养在无血清培养中成长。
本发明的无血清动物细胞培养基用于培养动物细胞，与有血清下游产品衔接较好，根据技术监督局批准的企业标准Q/TOSC-2003的规程来检验产品经培养细胞一般从1～5×104经三天培养后达到1×106，在无血清阶段细胞数量达到1×106能够满足有关部门的需要。
具体实施例方式
实施例中，基础培养基MEM的组分和重量份数含量采用参考文献stanners，N.P；Eliceiri，G.L；Green，HNature New Biology 23052-54(1971)公开的技术；GlasgowMEM组分和重量份数含量采用参考文献House，WMedical Research Council，Institute of Visology University ofGlasgow Scotland November 1964.均采用上海旭太生物有限公司的市售产品，实施例1～2BHK21细胞无血清培养基(粉末)实施例1实施例2A组 单位g A组 单位gMEM 500 GlasgowMEM 500丙酮酸钠11丙酮酸钠 11谷胱甘肽0.05 谷胱甘肽 0.05硫酸锌·7H2O0.0866硫酸锌·7H2O 0.0863维生素C 0.00566 维生素C 0.00566硫酸亚铁·7H2O 0.13 硫酸亚铁·7H2O 0.13柠檬酸三钠 0.13 柠檬酸三钠 0.13维生素B12 0.0136维生素B120.0136次黄嘌呤0.03 次黄嘌呤 0.03硫辛酸 0.0206硫辛酸 0.0206L-丙氨酸 0.89L-门冬氨酸 1.32L-谷氨酸 1.47
甘氨酸 0.75L-脯氨酸 1.15L-丝氨酸 1.05L-门冬酰胺 1.32B组 单位g B组 单位g必需脂肪酸*0.00841 必需脂肪酸*0.00841痕量元素A*0.5 痕量元素A*0.5痕量元素B*0.5 痕量元素B*0.5痕量元素C*0.5 痕量元素C*0.5痕量元素D*0.5 痕量元素D*0.5维生素E 0.01维生素E 0.01胆固醇 0.02胆固醇 0.02盐酸丁二胺 0.02盐酸丁二胺 0.0161生物素 0.000733生物素 0.000733吐温80 0.5 吐温80 0.5L-丙氨酸-谷氨酰胺 60实施例1中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；生物素选自市售D生物素。
实施例2中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；
痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；生物素选自市售D生物素。
制备方法a.按照比例，将A部分的原料在70℃下真空干燥24小时；B部分的原料在45℃真空干燥24小时；b.将干燥后的A部分原料球磨3小时，然后过40目筛成为固态粉末状中间体；c.将B部分原料与A部分原料混合，球磨3小时，可采用市售双头2缸球磨机，然后过40目筛，获得产品。
实施例3～4Vero细胞无血清培养基(粉末)实施例3实施例4A组 单位g A组 单位gDMEM 500 DMEM 500谷胱甘肽 0.05 谷胱甘肽 0.05硫酸锌·7H2O0.0863 硫酸锌·7H2O0.0863维生素C 0.011维生素C 0.00566柠檬酸三钠 0.13 柠檬酸三钠 0.13偏硅酸钠 0.014维生素B120.0136维生素B120.0136 次黄嘌呤 0.03次黄嘌呤 0.03 硫辛酸 0.0206硫辛酸 0.0206 硫酸亚铁·7H2O 0.13L-丙氨酸-谷氨酰胺60
B组 单位g B组单位g必需脂肪酸*0.016 必需脂肪酸*0.0084痕量元素A*0.5 痕量元素A*0.5痕量元素B*0.5 痕量元素B*0.5痕量元素C*0.5 痕量元素C*0.5痕量元素D*0.5 痕量元素D*0.5维生素E 0.001 维生素E0.001胆固醇0.02 胆固醇 0.02盐酸丁二胺0.0161盐酸丁二胺 0.0161生物素0.000733 生物素 0.000733吐温800.5 吐温80 0.5硫酸亚铁·7H2O 0.13实施例3中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；生物素选自市售D生物素。
实施例4中，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；生物素选自市售D生物素。
制备方法同实施例1。
实施例5将1～5×104的BHK21细胞接种于2ml实施例1的培养基，然后在18～24℃下无菌培养48小时，采用Q/TOSC-2003企业标准规定以定量法的方法计数细胞，进行检测，结果如下细胞形态饱满，稳定；在所需生长周期内恰好完成生长数量任务。
由此可见，本发明的培养基工艺，具有使所生产的无血清培养基达到可用，稳定的效果。
实施例6将1～5×104的Vero细胞接种于2ml实施例4的培养基，然后在18～24℃下无菌培养培养48小时，采用Q/TOSC-2003企业标准规定以定量法的方法计数细胞，进行检测，结果如下细胞形态饱满，稳定；在所需生长周期内恰好完成生长数量任务。
由此可见，本发明的培养基本发明的培养基工艺，具有使所生产的无血清培养基达到可用，稳定的效果。
权利要求
1.一种无血清动物细胞培养基，其特征在于，由A部分和B部分组成，以无血清动物细胞培养基的总重量为基准，A部分和B部分的组分和重量份数包括A部分基础培养基 1000份丙酮酸钠 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸锌·7H2O 0.1732份维生素C0.01132份硫酸亚铁·7H2O 0.26份柠檬酸三钠 0.26份维生素B12 0.0544份次黄嘌呤 0.12份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-门冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.23份L-丝氨酸 2.1份L-门冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A1份痕量元素B1份痕量元素C1份痕量元素D1份维生素E 0.02份胆固醇 0.04份盐酸丁二胺 0.0322份生物素 0.001466份吐温80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺120份。
2.根据权利要求1所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，所说的必需脂肪酸选自上海旭太产旭字牌必需脂肪酸M；所说的痕量元素A选自上海旭太产旭字牌痕量元素A；痕量元素B选自上海旭太产旭字牌痕量元素B；痕量元素C选自上海旭太产旭字牌痕量元素C；痕量元素D选自上海旭太产旭字牌痕量元素D；生物素选自市售D生物素。
3.根据权利要求1所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，优选的A部分和B部分的组分和重量份数包括A部分基础培养基 1000份丙酮酸钠22份谷胱甘肽0.1份硫酸锌·7H2O0.1732份维生素C 0.01132份硫酸亚铁·7H2O 0.26份柠檬酸三钠 0.26份维生素B12 0.272份次黄嘌呤0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸1.78份L-门冬氨酸 2.64份L-谷氨酸2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸2.3份L-丝氨酸2.1份L-门冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A 1份痕量元素B 1份痕量元素C 1份痕量元素D 1份维生素E 0.02份胆固醇 0.04份盐酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐温80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺 120份。
4.根据权利要求3所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，优选的A部分和B部分的组分和重量份数包括A部分基础培养基 1000份丙酮酸钠 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸锌·7H2O 0.1732份维生素C0.01132份硫酸亚铁·7H2O 0.26份柠檬酸三钠 0.26份维生素B12 0.272份次黄嘌呤 0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-门冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.3份L-丝氨酸 2.1份L-门冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A 1份痕量元素B 1份痕量元素C 1份痕量元素D 1份维生素E0.02份胆固醇 0.04份盐酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐温80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺 120份。
5.根据权利要求1～4任一项所述的无血清动物细胞培养基，其特征在于，动物细胞为BHK21细胞或Vero细胞。
6.制备权利要求1～5任一项无血清动物细胞培养基的方法，包括如下步骤a.按照比例，将A部分的原料在60～80℃下真空干燥18～30小时；B部分的原料在30～50℃真空干燥18～30小时；b.将干燥后的A部分原料球磨2～4小时，然后过30～50目筛成为固态粉末状中间体；c.将B部分原料与A部分原料混合，球磨2～4小时，可采用市售双头2缸球磨机，然后过30～50目筛，获得产品。
全文摘要
本发明公开了一种无血清动物细胞培养基及其制备方法。无血清培养基是一种不需要动物血清的人工合成培养基，它可避免动物血清在细胞培养过程中带来的污染和血清中不明成分对培养结果造成不确定影响。本发明公开的技术成品为粉末型便于运输，特别为配合有血清下游产品衔接操作而设计的方法，但是，其存在着血清与培养基双成本；血清对环境污染大，后续处理成本高；使用血清后对培养结果产生一定概率的不确定因素；的缺陷，因此必须进行改进，最好的办法是避免使用血清，而本发明方法可使生产无血清培养基时减低成本便于操作，从而使得在低成本代价下产生高效益。
文档编号C12N5/06GK101033458SQ200610024459
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月7日 优先权日2006年3月7日
发明者徐俊杰, 徐斌 申请人:上海旭太生物工程有限公司