一种糖化酶的发酵培养基及其发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一种糖化酶的发酵培养基及其发酵方法，属于微生物发酵工程【技术领域】，所述发酵培养基为每1L水中含葡萄糖80～100g、有机氮与无机氮混合氮源61～63g，pH为5.3～5.5；所述有机氮为玉米浆与黄豆饼粉，无机氮为硝酸盐，所述玉米浆、黄豆饼粉与硝酸盐的质量比为30∶30∶1～3，本发明有益效果为有效提高糖化酶发酵中糖化酶的产率。
【专利说明】一种糖化酶的发酵培养基及其发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种糖化酶的发酵培养基及其发酵方法，属于微生物发酵工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]葡萄糖淀粉酶因其常作为淀粉糖化剂而得名糖化酶。该酶从淀粉分子的非还原性末端开始依次水解α -1, 4糖苷键，释放β -D-葡萄糖，也能缓慢水解α -1，6、a -1, 3糖苷键。广泛应用于食品、发酵和制糖等行业，产量大、应用广。
[0003]葡萄糖淀粉酶多来源于微生物，广泛存在于细菌(含古细菌)、酵母菌和真菌中。国内外多采用曲霉、根霉为糖化酶生产菌，因为其产糖苷转移酶的活性较低，糖化酶催化活性较高，而且在接近中性环境下，糖化酶的催化活性和热稳定性较强。我国糖化酶工业生产菌以黑曲霉、根霉为主，也曾使用过特有的红曲霉，国外主要为黑曲霉、泡盛曲霉和臭曲霉等。
[0004]氮源是细胞进行生长和代谢不可缺少的营养元素，也是酶分子的重要组成部分。工业生产中常用的有机氮源有玉米浆、蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉等，常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和尿素。在以米糠为基质的黑曲霉固态发酵糖化酶培养中，添加适量玉米浆、蛋白胨和铵盐都能提高糖化酶产量。向含玉米粉、玉米浆、麸皮和豆柏粉的培养基中添加硫酸铵，提高了黑曲霉AS3.4309液态产糖化酶活力。
[0005]参考文献:
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【发明内容】
[0010]本发明通过改进糖化酶发酵培养基的配方，使糖化酶产率提高。
[0011]本发明提供了一种糖化酶的发酵培养基，所述发酵培养基为每IL水中含葡萄糖80~100g、有机氮与无机氮混合氮源61~63g, pH为5.3~5.5 ;
[0012]所述有机氮为玉米浆与黄豆饼粉，无机氮为硝酸盐，所述玉米浆、黄豆饼粉与硝酸盐的质量比为30:30:1~3。
[0013]本发明所述玉米浆优选为工业级玉米浆，玉米浆浓度为36~40%，玉米浆蛋白质含量为38~42%。[0014]本发明所述黄豆饼粉优选为冷榨黄豆饼粉，黄豆饼粉粒度为80~100目，黄豆饼粉蛋白质含量为42~46%，黄豆饼粉水分为8~12%，黄豆饼粉酸价小于4 (KOH)/ (mg/g)。
[0015]本发明所述黄豆饼粉粒度进一步优选为80目。
[0016]现有糖化酶发酵培养基中的氮源仅为有机氮，而本发明不仅糖化酶发酵培养基中的氮源为有机氮和无机氮结合还控制有机氮的粒度，使糖化酶发酵周期不变但产率提高15 ~25%。
[0017]本发明的另一目的是提供一种糖化酶的发酵方法，所述发酵方法包括菌种活化步骤、种子培养步骤、糖化酶发酵步骤，所述糖化酶发酵步骤为将糖化酶生产菌的种子培养液接入上述发酵培养基中，在发酵65~75h时向发酵培养基中补料或不补料，发酵周期为7 ~8d ;
[0018]所述补料为补加的葡萄糖为发酵培养基中初始葡萄糖质量的1/10、补加的无机氮为发酵培养基中初始有机氮质量的1/60。
[0019]本发明通过控制无机氮补加时间和补加量，也使糖化酶产率提高。
[0020]本发明所述方法优选为包括如下步骤:
[0021]①菌种活化:将糖化酶生产菌菌落接种于活化培养基中，培养2.5~3.5d得到活化培养液；
[0022]所述活化培养基为每IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01 g、琼脂 0.5g，pH 为 5.4 ;
[0023]②种子培养:将步骤①所得活化培养液接入种子培养基中，培养2.5~3d得到种子培养液；
[0024]所述种子培养基为每IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.1~
5.4，淀粉液化后DE值为18~25 ;
[0025]③糖化酶发酵:将步骤②所得种子培养液接入发酵培养基中，在发酵65~75h时向发酵培养基中补料或不补料，发酵周期为7~8d ;
[0026]所述补料为补加的葡萄糖为发酵培养基中初始葡萄糖质量的1/10、补加的无机氮为发酵培养基中初始有机氮质量的1/60。
[0027]本发明所述方法优选为包括如下步骤:
[0028]①菌种活化:将糖化酶生产菌菌落接种于活化培养基中，30~32°C培养2.5~
3.5d，间歇摇动3~4次/d，每次摇动10~20转，得到活化培养液；
[0029]所述活化培养基为每IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、琼脂 0.5g，pH 为 5.4 ;
[0030]②种子培养:将步骤①所得活化培养液接入种子培养基中，活化培养液与种子培养基的体积比为1:10，在30~32°C下190~210r/min培养2.5~3d，得到种子培养液；
[0031]所述种子培养基为每IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.1~
5.4，淀粉液化后DE值为18~25 ;
[0032]③糖化酶发酵:将步骤②所得种子培养液接入发酵培养基中，种子培养液与发酵培养基的体积比为1:10，在30~32°C下190~210r/min发酵，在发酵65~75h时向发酵培养基中补料或不补料，发酵周期为7~8d ;
[0033]所述补料为补加的葡萄糖为发酵培养基中初始葡萄糖质量的1/10、补加的无机氮为发酵培养基中初始有机氮质量的1/60。
[0034]本发明有益效果为:
[0035]①有效提高糖化酶发酵中糖化酶的产率；
[0036]②降低发酵液中的残糖量，提高原料利用率，减少残糖对酶制剂提取的干扰；
[0037]③提高发酵液的pH值，减少发酵液对生产设备的腐蚀。
【具体实施方式】
[0038]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0039]下述发酵培养基中的玉米浆为工业级玉米浆，玉米浆浓度为38%，玉米浆蛋白质含量为40%。
[0040]下述发酵培养基中的黄豆饼粉为冷榨黄豆饼粉，黄豆饼粉粒度为80目，黄豆饼粉蛋白质含量为44%，黄豆饼粉水分为10%，黄豆饼粉酸价小于4 (KOH)/ (mg/g)。
[0041]下述糖化酶活力测定方法为:将发酵液除去菌体得到粗酶液，按照GB8276-2006测定糖化酶活力。
[0042]实施例1
[0043]一种糖化酶的发 酵方法，所述方法包括如下步骤:
[0044]①菌种活化:取4°C保存的斜面黑曲霉菌种，挑取健壮的黑曲霉菌落接种于50mL的活化培养基中，32°C培养3d，间歇摇动4次/d，每次摇动10转，得到活化培养液；
[0045]所述活化培养基为IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、琼脂 0.5g, pH 为 5.4，121°C灭菌 20min ；
[0046]②种子培养:从步骤①所得活化培养液中取5mL接入50mL的种子培养基中，在32°C下200r/min培养60h，得到种子培养液；
[0047]所述种子培养基为IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.3，淀粉液化后DE值为21，121。。灭菌20min ；
[0048]③糖化酶发酵:从步骤②所得种子培养液中取2mL接入20mL的发酵培养基中，在32°C下200r/min发酵，在发酵72h时向发酵培养基中补料，发酵周期为7d ；
[0049]所述发酵培养基为IL水中含葡萄糖100g、玉米浆30g、黄豆饼粉30g、硝酸盐2g，pH为5.4,葡萄糖115°C灭菌30min,其他121°C灭菌20min ；
[0050]所述补料为补加0.2g的葡萄糖和补加0.02g的硝酸盐。
[0051]糖化酶发酵所得粗酶液的糖化酶活力为9878U/mL，比现有糖化酶发酵培养基中氮源仅为有机氮的粗酶液糖化酶活力提高21%。
[0052]实施例2
[0053]一种糖化酶的发酵方法，所述方法包括如下步骤:
[0054]①菌种活化:取4°C保存的斜面黑曲霉菌种，挑取健壮的黑曲霉菌落接种于50mL的活化培养基中，32°C培养3d，间歇摇动3次/d，每次摇动10转，得到活化培养液；
[0055]所述活化培养基为IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、琼脂 0.5g, pH 为 5.4，121°C灭菌 20min ；
[0056]②种子培养:从步骤①所得活化培养液中取5mL接入50mL的种子培养基中，在32°C下200r/min培养60h，得到种子培养液；
[0057]所述种子培养基为IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.2，淀粉液化后DE值为24，121。。灭菌20min ；
[0058]③糖化酶发酵:从步骤②所得种子培养液中取2mL接入20mL的发酵培养基中，在31°C下210r/min发酵，发酵周期为7d ；
[0059]所述发酵培养基为IL水中含葡萄糖100g、玉米浆30g、黄豆饼粉30g、硝酸盐3g，pH为5.4,葡萄糖115°C灭菌30min,其他121°C灭菌20min ；
[0060]糖化酶发酵所得粗酶液的糖化酶活力为8530U/mL，比现有糖化酶发酵培养基中氮源仅为有机氮的粗酶液糖化酶活力提高17%。
[0061]实施例3
[0062]一种糖化酶的发酵方法，所述方法包括如下步骤:
[0063]①菌种活化:取4°C保存的斜面黑曲霉菌种，挑取健壮的黑曲霉菌落接种于50mL的活化培养基中，32°C培养3d，间歇摇动4次/d，每次摇动10转，得到活化培养液；
[0064]所述活化培养基为IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、琼脂 0.5g, pH 为 5.4，121°C灭菌 20min ；
[0065]②种子培养:从步骤①所得活化培养液中取5mL接入50mL的种子培养基中，在32°C下200r/min培养6 0h，得到种子培养液；
[0066]所述种子培养基为IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.4，淀粉液化后DE值为18，121°C灭菌20min ；
[0067]③糖化酶发酵:从步骤②所得种子培养液中取2mL接入20mL的发酵培养基中，在30°C下200r/min发酵，在发酵72h时向发酵培养基中补料，发酵周期为7d ；
[0068]所述发酵培养基为IL水中含葡萄糖100g、玉米浆30g、黄豆饼粉30g、硝酸盐lg，pH为5.4,葡萄糖115°C灭菌30min,其他121°C灭菌20min ；
[0069]所述补料为补加0.2g的葡萄糖和补加0.02g的硝酸盐。
[0070]糖化酶发酵所得粗酶液的糖化酶活力为9490U/mL，比现有糖化酶发酵培养基中氮源仅为有机氮的粗酶液糖化酶活力提高16%。
【权利要求】
1.一种糖化酶的发酵培养基，所述发酵培养基为每IL水中含葡萄糖80~100g、有机氮与无机氮混合氮源61~63g, pH为5.3~5.5 ; 所述有机氮为玉米浆与黄豆饼粉，无机氮为硝酸盐，所述玉米浆、黄豆饼粉与硝酸盐的质量比为30:30:1~3。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于:所述玉米浆为工业级玉米浆，玉米浆浓度为36~40%，玉米浆蛋白质含量为38~42%。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于:所述黄豆饼粉为冷榨黄豆饼粉，黄豆饼粉粒度为80~100目，黄豆饼粉蛋白质含量为42~46%，黄豆饼粉水分为8~12%，黄豆饼粉酸价小于4 (KOH)/ (mg/g)。
4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于:所述黄豆饼粉粒度为80目。
5.一种糖化酶的发酵方法，其特征在于:所述发酵方法包括菌种活化步骤、种子培养步骤、糖化酶发酵步骤，所述糖化酶发酵步骤为将糖化酶生产菌的种子培养液接入权利要求1、2、3或4所述的发酵培养基中，在发酵65~75h时向发酵培养基中补料或不补料，发酵周期为7~8d ; 所述发酵培养基为每IL水中含葡萄糖80~100g、有机氮与无机氮混合氮源61~63g，pH 为 5.3 ~5.5 ; 所述有机氮为玉米浆与黄豆饼粉，无机氮为硝酸盐，所述玉米浆、黄豆饼粉与硝酸盐的质量比为30:30:1~3 ; 所述补料为补加的葡萄糖为发酵培养基中初始葡萄糖质量的1/10、补加的无机氮为发酵培养基中初始有机氮质量的1/60。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: ①菌种活化:将糖化酶生产菌菌落接种于活化培养基中，培养2.5~3.5d得到活化培养液； 所述活化培养基为每 IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HP04lg、MgS04.7Η200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、琼脂 0.5g，pH 为 5.4 ; ②种子培养:将步骤①所得活化培养液接入种子培养基中，培养2.5~3d得到种子培养液； 所述种子培养基为每IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.1~5.4，淀粉液化后DE值为18~25 ; ③糖化酶发酵:将步骤②所得种子培养液接入发酵培养基中，在发酵65~75h时向发酵培养基中补料或不补料，发酵周期为7~8d ; 所述发酵培养基为每IL水中含葡萄糖80~100g、有机氮与无机氮混合氮源61~63g，pH 为 5.3 ~5.5 ; 所述有机氮为玉米浆与黄豆饼粉，无机氮为硝酸盐，所述玉米浆、黄豆饼粉与硝酸盐的质量比为30:30:1~3 ; 所述补料为补 加的葡萄糖为发酵培养基中初始葡萄糖质量的1/10、补加的无机氮为发酵培养基中初始有机氮质量的1/60。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: ①菌种活化:将糖化酶生产菌菌落接种于活化培养基中，30~32°C培养2.5~3.5d，间歇摇动3~4次/d，每次摇动10~20转，得到活化培养液； 所述活化培养基为每 IL水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HP04lg、MgS04.7Η200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、琼脂 0.5g，pH 为 5.4 ; ②种子培养:将步骤①所得活化培养液接入种子培养基中，活化培养液与种子培养基的体积比为1:10，在30~32。。下190~210r/min培养2.5~3d，得到种子培养液； 所述种子培养基为每IL水中含淀粉120g、黄豆粉20g、玉米浆20g，pH为5.1~5.4，淀粉液化后DE值为18~25 ; ③糖化酶发酵:将步骤②所得种子培养液接入发酵培养基中，种子培养液与发酵培养基的体积比为1:10，在30~32°C下190~210r/min发酵，在发酵65~75h时向发酵培养基中补料或不补料，发酵周期为7~8d ; 所述发酵培养基为每IL水中含葡萄糖80~100g、有机氮与无机氮混合氮源61~63g，pH 为 5.3 ~5.5 ; 所述有机氮为玉米浆与黄豆饼粉，无机氮为硝酸盐，所述玉米浆、黄豆饼粉与硝酸盐的质量比为30:30:1~3 ; 所述补料为补加的葡萄糖为发酵培养基中初始葡萄糖质量的1/10、补加的无机氮为发酵培养基中初始有机氮质`量的1/60。
【文档编号】C12N9/34GK103865901SQ201410139281
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】李宪臻, 孙玉梅, 王伟 申请人:大连工业大学