恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。
【背景技术】
[0002]恶性胸腔积液(malignant pleural effus1n，MPE)是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液。据统计，美国每年MPE的患者数超过150000人。几乎所有的恶性肿瘤均可出现MPE。肺癌是最常见的病因，约占MPE的1/3，乳腺癌次之，淋巴瘤也是导致出现MPE的重要原因，卵巢癌和胃肠道癌出现MPE者也不少见，5%-10%的MPE找不到原发肿瘤病灶。一旦出现MPE表明肿瘤播散或已进展至晚期，患者预期寿命将显著缩短。MPE从确立诊断开始计算，中位生存期为3-12个月，这与原发肿瘤类型和分期有关。已有证据显示，肺癌所致MPE患者生存期最短，卵巢癌所致MPE生存期最长，无法找到原发灶的MPE患者生存期介于上述两者之间。
[0003]由于恶性胸腔积液的病因非常复杂，胸腔积液中的细胞成分也相当复杂，而且MPE确立诊断后，患者生存期都不长，所以，很少有MPE的相关研究工作尤其是其机理和免疫治疗研究工作报道，目前国内外针对MPE流行病学的调查研究资料十分缺乏。当下，临床上诊断和鉴定胸腔积液最常用的方法是采用胸腔穿刺进行细胞学检查，但是该方法存在敏感性较低、主观性较强的弊端，容易造成漏诊或误诊，因此需要寻找新的更敏感可靠的检测指标。
[0004]外泌体(Exosome)是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在外周循环中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，在肿瘤生长与转移中发挥调控作用。
[0005]外泌体也能被肿瘤细胞释放在胸腔积液中，但是其为什么会被肿瘤释放到胸膜内以及发挥何种作用尚不清楚。现有的从胸腔积液中提取外泌体的方法复杂且设备要求高，例如，文献报道了蔗糖梯度超离心法提取胸腔积液的外泌体的方法，该方法步骤繁杂费时，损耗量大，而且还需配置超高速离心机，这些都大大限制了研究者对其的研究。此外，胸腔积液中的外泌体来源复杂，无法评估其中属于肿瘤细胞分泌的外泌体。基于以上的限制，目前尚未有文献公开报道从胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，能够从肿瘤患者的胸腔积液中获得高量、特异性高且能直接用于后续的流式技术检测的肿瘤细胞来源的外泌体。
[0007]一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤:
[0008](I)将恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在2?8°〇、300?50(^离心10?15分钟，分离得到上层液体;将所述上层液体移入第二离心管中，在2?8°C、10000?12000g离心1?15分钟，分离得到上清液；
[0009](2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，2?8°C孵育6?16小时，然后，将孵育后的混合液在2?8°C、10000?12000g离心60?80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；
[0010](3)将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhes1n molecule，EpCAM)抗体标记磁珠的第四离心管中，在2?8°C孵育6?16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2?10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
[0011]其中，所述胸腔积液总外泌体的重悬液是将所述胸腔积液总外泌体用缓冲液进行重悬得到的，其中，所述缓冲液的PH值为7?8。所述缓冲液优选为磷酸缓冲液(PhosphateBuffered Saline,PBS)，更优选为I X磷酸缓冲液。
[0012]本发明优选的技术方案中，还可以对所得产物进行进一步清洗，S卩:在步骤(3)之后，向所述第四离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的PH值为7?8，然后将所述第四离心管置于磁力架吸附2?10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。优选重复该清洗步骤2?3次。优选所述的缓冲液为磷酸缓冲液，最优选为I X磷酸缓冲液。
[0013]本发明中，所述的总外泌体抽提液可以采用现有技术中常用的市售总外泌体抽提液，例如:Exosome Isolat1n kit(Life Technologies)、Exoquick(System B1science)、Exo_spin(Cell Guidance System)等；优选Invitrogen公司生产的Total ExosomeIsolat1n，可由市场购得。
[0014]本发明中，所述的上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠可以通过商业途径购买得到，例如:Exosome-Human EpCAM Isolat1n Reagent(Invitrogen)nCD326(EpCAM)MicroBeads(Miltenyi B1tec)、EasySep? Human EpCAM Positive Select1n Kit(StemCell);优选Invitrogen公司生产的EpCAM beads。
[0015]本发明中，优选胸腔积液样本的体积为2?5ml。在最优选的技术方案中，经由两次离心分离得到的上清液的体积不超过lml，而所用总外泌体抽提液的体积不超过lml，这样，所用总外泌体抽提液的成本不超过80元。
[0016]因此，本发明还提供了以下优选的技术方案:
[0017]—种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤:
[0018](I)将2?5ml恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在4°C、300?500g离心10?15分钟，分离得到上层液体;将所述上层液体移入第二离心管中，在4°C、10000?12000g离心1?15分钟，分离得到上清液；
[0019](2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，4°C孵育6?16小时，然后，将孵育后的混合液在4°C、10000?12000g离心60?80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；
[0020](3)将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第四离心管中，在4°C孵育6?16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2?10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。
[0021]其中，所述胸腔积液总外泌体的重悬液是将将所述胸腔积液总外泌体用0.5?2.5ml缓冲液进行重悬得到的，其中，所述缓冲液的pH值为7?8。所述缓冲液优选为磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，更优选为I X磷酸缓冲液。
[0022]同样，在优选的技术方案中，还可以对所得产物进行进一步清洗，S卩:在步骤(3)之后，向所述第四离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的PH值为7?8，然后将所述第四离心管置于磁力架吸附2?10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。优选重复该清洗步骤2?3次。优选所述的缓冲液为磷酸缓冲液，最优选为I X磷酸缓冲液。
[0023]将通过上述方法制备得到的产物进行电子显微镜观察、免疫印迹检测、流式细胞仪分析和Real-time PCR检测，结果发现:产物具有exosome的双膜50_100nm的大小形态，表达了exosome表面特有的蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsgl01，以及Epcam蛋白，并且在产物中检测到了一些肿瘤高表达的miR-21的表达，从而，分别从形态学层面、蛋白层面和小分子RNA层面证实了该产物为肿瘤来源的外泌体，为后续的胸腔积液肿瘤来源exosome的临床应用及下一步的研究工作奠定了基础。
[0024]本发明的恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括:进行胸腔积液中总外泌体的提取和磁珠抗体的纯化。在从恶性胸腔积液中提取总外泌体的过程中，将样本的去细胞预处理和使用抽提试剂(总外泌体抽提液)抽提相结合，克服了目前使用超高速离心机进行梯度离心所存在的方法复杂和有线粒体、大蛋白复合物等其他细胞碎片污染的缺陷;在磁珠抗体纯化的过程中，采用EpCAM抗体标记磁珠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，从而使在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物