信息。而且，本发明制备得到的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体可直接用于后续的流式技术检测。综上，本发明方法简单可行，首次实现了胸腔积液中肿瘤源外泌体的提取;本发明方法方便有效，实现了胸腔积液中可检测浓度的肿瘤源外泌体的获得;本发明方法准确可靠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，实现了在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。
[0025]相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果:
[0026]本申请发明人基于长期的外泌体研究，克服了基于长期以来对于胸腔积液中外泌体提取困难的认识所造成的局限性，将二次高速离心和抽提试剂结合，完成了胸腔积液中总外泌体的提取，并进一步采用EpCAM抗体标记磁珠提纯得到胸腔积液中可检测浓度的肿瘤来源的外泌体，该外泌体特异性强，能够有效提高后续临床诊断应用及研究的准确性。
[0027]本发明所公开的方法，能够简单有效低成本地实现从恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体，从而使得后续的机理研究和免疫治疗应用成为可能，具有极大的理论价值和临床应用价值。
[0028]而且，本发明所公开的方法，只需要在1000g高速离心即可实现，一般检测实验室均能满足该条件，相对而言，现有技术中对于外泌体的提取则是必须要求10000g以上的超高速离心，对设备要求高，所需要的费用也高，严重限制了其应用。就此而言，本发明方法在临床应用上更适合推广。
[0029]综合而言，本发明方法具有特异性强、准确可靠、方便易行、简单有效、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有良好的临床应用前景。
【附图说明】
[0030]图1是本发明实施例1所得产物的电子显微镜照片。
[0031]图2是对本发明实施例1所得产物中的蛋白⑶9、⑶63、Hsp90、Tsgl01表达的免疫印迹(Western Blot)检测结果。
[0032]图3是对本发明实施例1所得产物中EpCAM表达进行流式细胞仪分析的检测结果。
[0033]图4是对本发明实施例1所得产物进行Real-timePCR检测的结果。
[0034]图5是对本发明实施例2所得产物中CD63的表达进行流式细胞仪分析的检测结果。
[0035]图6a是本发明实施例2所得产物在明场的磁珠光图；图6b是对本发明实施例2所得产物进行荧光免疫检测所显示的磁珠荧光图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0037]实施例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件或者制造厂商所建议的条件实施。
[0038]本发明中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。
[0039]实施例1:肺癌患者胸腔积液中肿瘤细胞来源exosome的提取
[0040]①得到患者知情及伦理的同意下，收集肿瘤患者病人(病理活检已经确认为肺癌)术前的胸腔积液标本2ml于1ml第一离心管中，在4°C、300g的离心条件下离心10分钟，分离以去除胸腔积液中的细胞，然后得到上层液体。
[0041 ]②将①得到的上层液体移入第二离心管中，在4°C、1000g的离心条件下离心15分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液。
[0042]③将上清液移入第三离心管中，并加入与上清液的体积相同量的exosome抽提液(Total Exosome Isolat1n, Invitrogen)混合，震荡均勾后，4°CfP?育过夜(6?16小时均可)，然后，将孵育后的混合液在4°C、10000g离心I小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的胸腔积液总外泌体(exosome)。
[0043]④用0.5ml的IxroS(pH值为7?8)对③所得胸腔积液总外泌体进行重悬，得到胸腔积液总外泌体的重悬液。
[0044]⑤将20ul抗体磁珠(EpCAM beads, Invitrogen)和Iml的I XPBS在第四离心管中混匀后上磁力架吸附2分钟，移除管内液体，这样在该离心管中吸附有EpCAM抗体标记磁珠。
[0045]⑥将上述④所得的0.5ml胸腔积液总外泌体的重悬液加入上述⑤所得的吸附有EpCAM抗体标记磁珠的第四离心管中，4°C孵育过夜(6?16小时均可)。
[0046]⑦将⑥中的第四离心管置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体。
[0047]⑧再向上述第四离心管中加入Iml的IXI3BS，置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体;重复一次;获得磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome。
[0048]整个过程在无菌操作台完成，避免细菌、真菌等的污染。由于IX PBS和exosome抽提液通常在4°C保存，在取用后的短时间内进行重悬、混合或磁力吸附操作，基本仍能保持在4°C，所以，上述整个过程可视为均在4°C下进行操作。
[0049]产物的表征和鉴定
[0050]1、将实施例1得到的产物(S卩，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用Iml低pH(pH值为5-6)的TE缓冲液洗脱磁珠上结合的细胞，并使用电子显微镜观察。电子显微镜观察到的照片如图1所示，可以发现:从磁珠上洗脱下的细胞为50-100nm大小的双分子层膜结构泡体，形态学和其他文献报道的外泌体一致。
[0051]2、免疫印迹(Western Blot)检测蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsgl01 的存在
[0052]具体检测步骤如下:
[0053](I)将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用Iml的I XPBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，加入Iml裂解液，提取总蛋白。
[0054](2)制作BSA标准曲线，加入Iml的考马斯蓝，化学分光仪上检测exosome蛋白含量。
[0055](3)制作10%及4%的梯度胶，加入足够的缓冲液，每孔上样50ug的exosome总蛋白。
[0056](4)在电压40V?60V进行4?5h的电泳。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
[0057](5)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗I?2分钟，以洗去膜上的转膜液。后加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
[0058](6)封闭结束后，立即加入稀释好的一抗(0)9，0)63，!1叩90，1'叩101)。4°(3缓慢摇动孵育过夜后，回收一抗，Western洗涤液洗涤3次。
[0059](7)按照适当比例用Western 二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温或4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，Western洗涤液洗涤3次。
[0060](8)膜上蛋白面加入ECL液进行显影。
[0061]检测结果如图2所示，其中，T1、T2、T3代表单样品重复，从图2可以发现:在实施例1所得产物中检测到了 exosome表面特有的蛋白CD9、CD63、Hsp90、Tsgl01的表达，因此，从分子特性上说明了实施例1所得产物为exosome。
[0062]3、流式细胞仪检测肿瘤exosome的EpCAM表达
[0063]将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用Iml的I X PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，分别加入Epcam-FITC和Igm-FITC抗体进行4°C闭关孵育I小时后，磁力架上用Iml的I X PBS清洗3次后，加入500ul的I X PBS上流式细胞仪进行检测。
[0064]检测结果如图3所示，可以发现:在实施例1所得产物(如图3中线2所示)中检测到了 EpCAM蛋白表达，且荧光强度强于同型对照组(如图3中线I所示)。这说明了实施例1所得产物为肿瘤细胞来源的exosome。
[0065]4、Real-time PCR检测miR-21 及U6表达
[0066](I)总miRNA提取:用350ul的I X PBS重悬由上述实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)，并加入700ul Qiazol (Qiagen)裂解后，加入200ul甲醇震动混匀，分2次移入总RNA抽提柱中，12000rpm离心移除离心液；依次加入700ul缓冲液RWT和700ul缓冲液RPE液进入离心柱，12000rpm离心10分钟后移除离心液；利用miRNA抽提系统(Qiagen)提取Total RNA，20ul Rnase-Free Water加入离心柱过膜，12000rpm离心 10分钟，获得离心液中包含Total RNA。
[0067](2)反转录:取Ilul total RNA、1ul的反应液(Takara)、2ul BSA'y^(Takara) n2u1RT液(Takara)