检测微生物的技术的制作方法

专利名称：：检测微生物的技术的制作方法检测微生物的技术发明背景快速检测微生物的能力正成为各种工业中越来越严重的问题。例如，食品(例如，肉)在其进入一个企业之前、期间或之后通常会^皮进行分析。然而，在消费食品之前通常没有进一步的测试，导致存在这样的可能，即未被检测到的食物传染病原体，例如沙门氏菌和李斯特氏菌(5^/mowe〃a朋d丄"、化na)在产品的包装、运输以及展示期间将会繁殖到不期望的水平。例如，小于3。C的温度升高可以使食物保存期限缩短50%并且导致细菌生长随时间明显的增加。实际上，基于每克食品上103菌落数("cfu")的总致病性和非致病性细菌负载量，在37t:下仅在短短几个小时内就可以发生食物的腐败。食物安全领导者已经将该水平视为肉制品可接受阈值的最大值。已知许多装置都可以提供反映细菌负载量或者食物新鲜程度的诊断性检测，包括时间-温度指示剂装置。迄今为止，由于所应用的技术的原因这些装置中没有一个被广泛地接受。例如，包膜装置一般要求与细菌实际的接触。然而，如果细菌处于外部食物表面的内部，那么在食物内部的高细菌负载量就不能激活传感器。已经开发了氨传感器，但其仅能够检测分解蛋白质的细菌。因为细菌在最初利用碳水化合物，这些传感器在许多应用中仅具有低灵敏度。试图克服这些问题中的一部分而开发了几种装置。例如，Morris等4的美国专利申请公开No.2004/0265440描述了一种在易腐败食品中检测细菌的传感器。该传感器包括含有pH指示剂的透气材料，所述指示剂由机架(housing)负载，所述机架位于与食品或包装表面有空间关系的位置。所述指示剂能够检测反映了细菌生长的气态细菌代谢物浓度的变化，其中pH的变化受到代谢物存在的影响。例如，pH指示剂(例如，溴百里酚蓝和甲基橙的混合物)在二氧化碳气体水平增加的情况下将呈现一个从绿色到橙色的可见颜色变化，所述二氧化碳气体通过pH指示剂而扩散，减少了氢离子的浓度并且因此降低了PH。遗憾的是，这样的pH指示剂仍然存在问题。例如，检测到降低的pH仅表示一些细菌可能存在。但是，该降低的pH没有提供关于存在何种类型细菌的指示。由于各种原因，对选择性鉴定细菌种类的需求是重要的。例如，一些细菌种类可能被认为是无害的。此外，对于存在哪种类型的细菌的认识也可以使人们能够鉴定具体的污染来源。同样地，目前存在着对快速简便检测微生物存在，并鉴定所检测微生物具体种类的技术的需求。发明概述根据本发明的一个实施方案，公开了一种检测微生物存在的方法。所萃取的顶::气体并且鉴定与微生物培养相关的挥发性化合物，选择在所鉴定的挥发性化合物的存在下能够呈现可检测颜色变化的指示剂。根据本发明的另一个实施方案，公开了一种检测微生物存在的方的挥发性化合物的存在下能够呈现可检测颜色变化的指示剂；和将该指示剂施加到基材表面。根据本发明的又一个实施方案，公开了用于检测多种微生物存在的基材。该基材至少包含第一和第二指示剂区域。第一指示剂区域中含有第一指示剂，其含量为与第一微生物所产生的第一挥发性化合物接触时能产生可检测颜色变化的有效量。第二指示剂包含于第二指示剂区域中，其含量为与第二微生物所产生的第二挥发性化合物接触时能产生可检测颜色变化的有效量。以下更加详细地讨论本发明的其它特点和方面。附图简述对于本领域普通技术人员来说，本发明完整有效的公开，包括其最佳方式，在说明书的余下部分被更加具体地阐明，所述的说明书的余下部分参照了以下附图图1是可以在根据本发明的一个实施方案中使用的固相微萃取"SPME"组件的示意图；图2是由实施例1中的铜绿假单细胞菌获得的总离子色谱图，其中挥发性化合物的丰度是相对于保留时间而绘制的；图3是由实施例2中的金黄色葡萄球菌获得的总离子色谱图，其中挥发性化合物的丰度是相对于保留时间而绘制的；图4是由实施例3中的大肠杆菌获得的总离子色谱图，其中挥发性化合物的丰度是相对于保留时间而绘制的；图5是由实施例4中的白色念珠菌获得的总离子色谱图，其中挥发性化合物的丰度是相对于保留时间而绘制的；图6是由实施例5中的沙门氏菌获得的总离子色谱图，其中挥发性化合物的丰度是相对于保留时间而绘制的；图7代表了图6中观察到一些差异的区域的放大形式。代表性实施方案的详细说明现在详细参考本发明的多种实施方案，下面给出了其中的一个或多个实施例。每个实施例是以对发明的解释的方式给出的，而不是对发明的限制。事实上，可以对本发明进4亍各种改进和变化而没有脱离本发明的范围或精神，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，可以将图解或描述为一个实施方案的一部分的特点用于另一个实施方案以产生更进一步的实施方案。因此，本发明意图覆盖这样的改进和变化，使其归入所附权利要求及其等效物的范围之内。本发明涉及一种以简单、快速且有效的方式检测微生物存在的技术。更具体地说，该技术包括鉴定一种或多种与所关心的特定微生物相关的挥发性化合物。所述挥发性化合物可以通过，例如，使用固相微萃取结合气相色谱/质谱("GC/MS")分析方法而被鉴定。一旦鉴定，接着就可以选择指示剂，所述指示剂被设定成在存在所鉴定的挥发性化合物(化合物们)时其能够呈现可检测的颜色变化。如果需要，可以在基材上提供所述指示剂以形成用于各种应用的指示剂带。以这样的方式，微生物的存在可以通过简单地观察指示剂带上颜色的变化而被迅速地检测。微生物，例如细菌、酵母、真菌、霉菌、原生动物、病毒等等，根据特定的特征被划分成多个组。例如，细菌一般基于它们的形态、染色特征、环境要求和代谢特征等来分类。几个医学上重要的细菌组包括，例如，革兰氏阴性杆菌(例如，Entereobacteria);革兰氏阴性曲线杆菌(#J长口，vAzowa幽/7对,Vf霧f//ehoZ^"erJ，',必,^fC"m户y/oM"er,等)；革兰氏阴性球菌(例如，#遼凡承霧虞rA^^enaJ,;革兰氏阳性杆菌(例如，^7^^霧虞(^"c/〃w入凝炎f孩许霧^^C/(^/^,画J等)；革兰氏阳性球菌(例如薪萄/^f^SV"//z少/oc(9cc仏v1J，链^4'^"^ff5Yre/^ococcws,等)；必需的月包内寄生物(例如，ji^^举^(^/c'A:e"扁J和^^举4rC/z/濯一'^);耐酸杆菌(例如A<voM"en'wm，诺7^《,虞6Vocwy/^,等)；螺旋菌(例如麥螺，凌#4^rn/wmwa入Bo"〃z'"等)；和类菌质体(即，没有细胞壁的微小细菌)。特別是相关的细菌包括大肠杆菌(革兰氏阴性杆菌)，肺炎克雷伯杆菌(《/eZwe〃fl)(革兰氏阴性杆菌)，链球菌(革兰氏阳性球菌)，猪霍乱沙门氏菌(^2/wo"e〃"c/zo/eraesw^)(革兰氏阴性杆菌)，金黄色葡萄球菌(Sto/7/^/occw5aww)(革兰氏阳性球菌)以及铜绿假单细胞菌(尸.(革兰氏阴性杆菌)。在特定的条件下，微生物生长并繁殖。生长所需要的条件可以包括合适养分的供给，能量源(例如，光营养的或化学营养的)，水，适当的温度，适当的pH,适当的氧气水平(例如，厌氧的或需氧的)，等等。例如，细菌可以利用广泛的化合物作为营养物，例如糖和碳水化合物，氨基酸，甾醇，醇类，烃类，曱烷，无机盐和二氧化碳。在具体细菌的最佳生长温度下，生长进行的最迅速(并且当温度由此最佳值升高或降低时其都会降低)。对于任何细菌来说都具有最低和最高温度，超过这个温度生长就不能维持。嗜热细菌具有大于45r的最佳生长温度，嗜中温细菌具有15和45。C之间的最佳生长温度(例如，人致病性细菌)，而嗜冷细菌具有低于15。C的最佳生长温度。许多种类的微生物，包括医学上重要的人类病原体，在生长和繁殖期间都产生挥发性化合物。本发明人发现一种或多种这些挥发性化合物好像仅与特定组、属、种和/或亚种的微生物相对应。因此，可以分析并检测技术。可以将所述挥发性化合物在或接近所关心应用的阈值安全水平的负载量下进行分析。例如，将每毫升原料1x103菌落数("cfu")的细菌负载量作为基于食物的应用中的阈值安全水平是可接受的。因此，在一些实施方案中，分析可以在每毫升原料至少约lxl(^cfu的负载量下进行。然而，应当理解选择用于试验的负载量可以与可接受的阈值水平相同或不同。也就是说，只要至少一种或多种挥发性化合物是可鉴定的，则较小的负载量也可以被检验到。案中，使用萃取的方法，例如索氏萃取、液-液萃取、快速溶剂萃取、微波-辅助溶剂萃取、固-相萃取和超临界流体萃取等等。一种特别合意的萃取技术是"固相微萃取"("SPME"),其允许在单一步骤中进行样品的萃取和预浓缩。在SPME中，固体熔融纤维的外表面用选择性固定相涂布。提供快速溶质扩散的热稳定聚合材料通常用作固定相。所述萃取操作是通过将涂布纤维末端浸入样品的顶部空间，并允许建立一个平衡而进4亍的。例如，参照图1,用于实现固相微萃取的装置2的一个实施方案被显示使用了注射器4。该注射器4由针筒8组成，所述针筒含有在针筒8内部滑动的活塞10。活塞IO具有从针筒8的一个末端14伸出的柄12。针18与针筒8的另外一端16通过连接器20相连通。装置2还包括纤维6,其是从针18伸出穿过针筒8并穿出末端14的固体线状材料。位于与柄12相邻位置的纤维6的一个末端(未示出)具有位于手柄上的固定装置22,从而使该纤维能够像活塞IO在针筒8内部滑动一样纵向地移动。该固定装置可以简单地是置于纤维6靠近柄8的末端上的一滴环氧树脂。纤维6被部分地装入金属套管24中，所述金属套管套住了纤维6在活塞10、针筒8和部分针18内部的部分。金属套管24的一个目的是保护纤维6免受损坏并且在装置运行期间确保良好的密封。从连接器20中伸出的是任选的入口26，其提供了到纤维6的替代通路。例如，当纤维6包含在针18中时，液体可以通过从入口26进入并且从针18的自由端28排出而与纤维6接触。入口26也可以用于将纤维6与活性溶剂接触。要进行固相微萃取和接下来的分析，用户可以简单地压下活塞10而使纤维6暴露于包括相关微生物培养物的容器、瓶子、盘、琼脂平板或任何其它样品固定器中。例如，该纤维可以是用液相(聚二曱硅氧烷、苯乙烯二乙烯基苯多孔聚合物，聚乙二醇、碳分子筛吸附剂以及它们的组合物等等)涂布的熔融二氧化硅。在培养期间，微生物生长并且产生相应的挥发性化合物。因此，样品固定器的顶部空间充满了挥发性化合物。在足够长的一段时间(例如，从约2到约30分钟)之后，所述顶隙组分被吸附到纤维6之上。而后，将活塞10移动到后退的位置以将纤维6拉入到针8中，然后从样品固定器中移出针8。然后将所吸附的顶隙组分通过加热从纤维液相中解吸以用于接下来的分析。适合用于本发明的一种SPME组件是从密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich，Inc.商购获得的，其名称为"Supelco"。"Supelco"系统使用手动纤维夹持器(目录编号57330-U)和涂布有85^m-CarboxenTM/poly-dimethylsilicone(目录编号57334-U)的StableFlex纤维。这样的纤维被推荐用于气体或低分子量化合物。此外，多种其它萃取技术也可以用于本发明，例如Pawliszyn的羞国告刺Nos.5,691,206;Pawliszyn的募国告刺Nos.6,537,827;Malik等人的美国专利Nos.6,759,126和Jinno等人的美国专利Nos.6,780,314中所描述的,所有的这些均在此全文引入为了所有的目的而作为参考。萃取之后通常进行色语分析，其中萃取的化合物在进样口被解吸以便将其引入色谱柱中。例如，在一个实施方案中，使用气相色谱仪("GC")用于本发明。气相色i普仪("GC，，)是获得气态样品并将样品分离成单独化合物，以提供对所述化合物的鉴定和定量的分析仪器。一般的气相色谱仪包括进样器和分离柱(例如，长的，盘管的)，所述进样器将样品组分转化成气态并将该气体移动到窄频带中的分离柱的顶部，所述分离柱在样品混合物通过惰性载气吹扫通过分离柱时将样品混合物分离成单独组分。分离是以组分与柱中固定的液体或固体材料之间的不同的相互作用为基础而进行的。例如，当应用于本发明中时，将所萃取的顶隙气体接收到气相色谱仪的入口中。接着，气体通过分离分子的柱子。不同的样品组分在柱中保留不同长度的时间，并且在特征保留时间到达。这些"保留时间"可以用于鉴定具体的样品组分，并且器随着柱中吸收材料的种类和数量、柱长和直径、载气类型和流速以及柱温而变化。气相色谱仪通常是可控加热或冷却的，以帮助获得可再现的保留时间。例如，可以使用加热室，所述加热室对涂有各种涂层(例如，聚珪氧烷基涂层)的聚酰亚胺或金属镀层熔融硅管进行加热。所述加热室可以使用电阻加热元件以及使热空气在加热室中循环的风扇。所述的柱子同样可以通过打开加热室中的通风孔，关闭加热元件并且利用环境空气或冷冻剂例如液态二氧化碳或液氮对所述柱子进行强制空气冷却而得到冷却。替代性地，可以使用金属套来加热毛细管GC柱。在这种情况下，将柱子穿入金属套中，然后在色谱过程期间进行电阻加热。如果希望，GC分析也可以与其它鉴定技术包括质谱("MS")相连接，以获得更精确的结果。质谱通常是用来对材料或材料混合物进行定量和定性化学分析的分析方法。在质谱中，样品(即，通过GC方法分离的)在离子源中被打碎成其组成部分的带电粒子。一旦产生，粒子将通过分光计以其各自的质荷比为基础被进一步地分离。接着检测离子并且产生材料的质谱。质谱类似于被分析样品材料的指紋，因为其提供了关于洗脱分子的离子强度的信息。尤其是，质语可以被用来确定分子的分子量和样品的分子碎片。质谱仪通常含有离子源，所述离子源能够从样品中产生离子。例如，可以使用的离子源的一个类型是电子电离(EI)室。质谱一般还含有至少一个根据它们的质荷比(m/z)来分离离子的分析器或过滤器，以及测量离子丰度的检测器。所述检测器，依次向产生样品质谱的数据处理系统提供输出信号。GC/MS系统的GC和MS部件可以是分离的或集成的。例如，适用于本发明的一个集成GC/MS系统是由科罗拉多州洛夫兰的AgilentTechnologies,Inc.商购获得的，其名称为"5973N"。各种其它气相色谱4义和/或质谱系统还描述于Overton的5,846,292;Quimby等人的6,691,053;Hastings等人的6,607,580;G歸ley等人的6,646,256;以及为参考。、不考虑所使用的具体筌定技术，通常希望能鉴定只有特定属、种和/或亚种的微生物才有的挥发性化合物。这样，可以选择用于所鉴定的挥发性化合物的具体指示剂。然而在实践中，可能难以容易地确定所鉴定的挥发性化合物是否真正是特有的。因此，所述特有的挥发性化合物可以以指示剂在使用期间可能遇到的微生物的种类为基础而被鉴定。例如，被认为与基于食物的应用相关的一些细菌种类包括大肠杆菌(Eco〃)、猪霍乱沙门氏菌(5".cAo/erae認^1)，金黄色葡萄球菌(S曙)和铜绿假单细胞菌(尸."ewgmo犯)。同样地，如果指示剂计划用于多种用途，可以测试更大数量的细菌种类。在另外的其它情况下，鉴定特定种类的微生物所特有的挥发性化合物甚至可能不是必要的或者是不希望的。例如，一种或多种挥发性化合物可能被鉴定成对应于一种类型的微生物，但是其也可能由另一种微生物产生。在这样的情况下，指示剂仍然鉴定了所述一种或多种微生物类型的存在。通常，指示剂能够容易地表征所鉴定的挥发性化合物的存在。在一个实施方案中，指示剂是在与挥发性化合物接触时显示可视或通过仪器可检测的颜色变化的染料。例如，在与挥发性化合物接触之前，该指示剂染料可以是无色的或者其可以具有某种颜色。然而，在与挥发性化合物接触之后，该染料显示出不同于其最初颜色的颜色变化。也就是说，该染料可以从第一颜色变化到第二颜色，从无色变化到有色，或者从有色变化到无色。虽然不要求，可检测的颜色变化可以是由向染料分子中加入官能团(例如，OH、NH2等等)而产生的，所述官能团的加入引导最大吸收向光谱红端移动("红移")或者向光谱蓝端移动("蓝移")。吸收移动的种类取决于染料分子的属性以及是否该官能团起到电子受体(氧化剂)的作用，其产生蓝移，或者是否该官能团起到电子给体(还原剂)的作用，其产生红移。无论怎样，吸收的移动都可以产生可检测的颜色差异。任意的各种已知指示剂都可以用于本发明。例如，一种这样的指示剂是4-二曱氨基肉桂醛，其是具有如下结构的乙烯基不饱和胺碱4-二甲氨基肉桂醛在吲哚的存在下能够呈现颜色的变化，所述吲哚通常具有如下结构另一种合适的指示剂是高锰酸钾，其具有如下结构:高锰酸钾是一种强氧化剂并且在易被氧化的化合物，例如醇、醛、不饱和烃等等的存在下能够呈现颜色的变化。这样的易被氧化的化合物的一个例子是2-甲基-2-丁烯酸曱酯，其具有如下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>另一个能够引起高锰酸钾颜色变化的化合物的例子是2,。秦，其具有如下结构-二甲基吡<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>又一种适当的指示剂是重铬酸铵，其具有如下结构:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>重铬酸铵也是一种强氧化剂并且在醇，例如具有分子式(CH3)2CHCH2CH2OH的异戊醇，的存在下能够呈现颜色的变化。进一步地，2,4-二硝基苯肼("DPNH")也是用于具有碳-氧双键(例如，醛和酮)的化合物的合适指示剂，其具有如下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>例如，DPNH(又名"Brady's试剂)在2-乙酰基p塞唑的存在下能够呈现颜色的变化，其具有如下结构除了以上提到的指示剂以外，一些其它通用指示剂和其相关的目标化合物在下面给出。指示剂目标化合物氨四环素硝酸铵铈(IV)多元醇苯胺/磷酸糖对氨基苯曱醛还原糖对氨基苯曱醚酞酸酯还原糖蒽酮酮糖三氯化铋甾醇溴曱酚绿有机和无机酸溴曱酚紫二羧酸，卣离子品红多糖显色好J黄酸有机化合物氯化钴(n)有机磷酸酯硫氰酸钴(n)生物44，胺a-环糊精直链脂质邻联二茴香胺醛，酮2,6-二溴醌氯化亚胺苯酚2',7'-二氯荧光黄饱和及不饱和脂质2,6-二氯酚吲哚酚，才几&复，酉同卧复八碳酰基二钴乙炔化合物丙二酸二乙酯3,5-二硝基苯曱酸酯3,5-二硝基苯甲酸还原糖2,4-二硝基氟苯氨基酸3,5-二硝基水杨酸还原糖二苯胺糖脂二苯卡巴腙阳离子4,4'-二硫代双苯胺硫醇乙二胺儿茶酚胺固蓝盐B(FastbluesaltB)苯酚，联胺荧光素脂质乙二醛缩双(2-羟苯胺)阳离子硫酸肼胡椒醛，香草醛，乙基香草醛盐酸烯糖过氧化氢芳香酸硫氰酸铁(II)过氧化物醋酸铅(IV)1,2-二酚基团乙酸镁蒽醌苦Methylunmbelliferone杂环化合物1-萘酚/次涣酸盐胍书t生物茚三酮氨基酸，胺，氨基-糖氯化钯(n)硫代磷酸酯苯酚A克酸糖间苯二胺还原糖苯基荧光酮锗苯肼脱氢纟it坏血酸酉昆葛素阳离子对醌乙醇胺绕丹宁类胡萝卜素醛硝酸纟艮笨酚硝普酸钠四氰乙烯四哇蓝石克代巴比妥酸二苯并吡喃醇偏高》爽酸钠百里酚蓝氯化锡(IV)曱苯胺蓝羟氨酸，丝氨酸，苏氨酸巯基化合物芳香烃，苯酚还原化合物山梨酸二曱基氨基酸三碎烯，苯酚，多酚酸性多斗唐色氨酸，吲哚衍生物所选择的指示剂通常以在某种微生物的存在下能够获得可检测颜色变化的有效量使用。指示剂获得期望的颜色变化的能力可以通过增加指示剂与微生物所产生的气体之间的接触面积来提高。而这样也可以减少获得期望颜色变化所需要的指示剂的量。一种以这样的方式增加表面积的技术是将指示剂施加到基材上。当使用时，可以将一种或多种指示剂施加到基材上以形成设计用来检测一种或多种微生物存在的指示剂带。例如，在一个实施方案中，所述指示剂带可以被设计成用以检测大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单细胞菌的存在。这可以通过使用单一的指示剂或多种指示剂(例如，四种)来完成。所述基材也可以用于实现其它目的，例如吸水、包装等。任意各种不同的基材都可以与根据本发明的指示剂联用。例如，无纺布、机织织物、棉、针织物、抗湿纸、薄膜、泡沫塑料等等都可以与指示剂联用。当使用时，无纺布可以包括但不限于，纺粘织物(有孔或无孑L)、火容p欠织4勿、津占才危(bondedcarded)织4勿、气;危成网(air-laid)织物、共成形织物、水压巻入(hydraulicallyentangled)织物等等。各种热塑性塑料材料可以用来构造无纺织物，包括但不限于聚酰胺，聚酯，聚烯烃，乙烯和丙烯共聚物，乙烯或丙烯与C4-C20ot-烯烃共聚物，乙烯和丙烯与C4-C2Q(X-烯烃的三元共聚物，乙晞乙酸乙晞酯共聚物，丙烯醋酸乙烯酯共聚物，苯乙烯-聚(乙烯-a-烯烃)弹性体，聚亚安酯，A-B嵌段共聚物其中A由聚(乙烯基芳烃)片段例如聚苯乙烯形成并且B是一个弹性体中段例如共轭二烯或者低级烯烃，聚醚，聚醚酯，聚丙烯酸酯，乙烯烷基丙烯酸酯，聚异丁烯，聚-l-丁烯，聚-l-丁烯共聚物包括乙烯-1-丁烯共聚物，聚丁二烯，异丁烯-异戊二烯共聚物，以及上述任意的组合。另一种合适的无纺织物是共成形材料，其一般是纤维素纤维与熔吹纤维的混合物。术语"共成形"通常是指包含热塑性纤维和第二非热塑性材料的混合物或稳定基质的复合材料。例如，共成形材料可以通过如下的方法制备，其中将至少一个熔吹模头设置在靠近斜道的位置，当共成形材料形成时其它材料是通过所述斜道加入到织物中的。这样的其它材料可以包括但不限于，纤维性有机材料例如木质或非木质纸浆例如棉花，人造丝，再生纸，纸浆绒毛以及超吸收颗粒，无机吸收材料和处理过的聚合人造短纤维等等。这样的共成形材料的一些例子公开于Anderson等人的美国专利No.4,100,324;Everhart等人的美国专利No.5,284,703以及Georger等人的美国专利No.5,350,624中；在此将其它们全文引入并为了所有的目的作为参考。所述指示剂也可以被用于纸制品中，所述纸制品包含一种或多种纸织物，例如化妆纸、沐浴棉纸、纸巾和餐巾等等。所述纸制品可以是单层的，其中织物形成的制品包括单一的层或是分层的(即，具有多个层)，或者是多层的，其中形成制品的织物本身可以是单或多层的。还可以使用任意的多种材料来形成纸织物。例如，该纸织物可以包括通过各种制浆方法，例如硫酸盐制浆(kmftpulp)、亚硫酸盐制浆、热机制浆等形成的纤维。此外，所述基材还可以包含薄膜。多种材料可以用于形成所述薄膜。例如，用于制造薄膜的一些合适的热塑性聚合物可以包括，但不限于，聚烯烃(例如，聚乙烯、聚丙烯等)，其包括均聚物、共聚物、三元共聚物及其混合物；乙烯醋酸乙烯酯；乙烯丙烯酸乙酯；乙烯丙烯酸；乙烯丙烯酸曱酯；乙烯丙烯酸正丁酯；聚氨基曱酸乙酯；聚(醚-酯)和聚(酰胺-醚)嵌段共聚物等等。通过是否包含薄膜、无纺织物等，本发明所使用基材的渗透性也可以根据具体的应用而改变。例如，在一些实施方案中，所述基材可以渗透液体。这样的基材，例如，可以用于各种液体的吸收和过滤应用。在其它实施方案中，所述基材可以是不透液体、气体和水蒸汽的，例如由聚丙烯或聚乙烯形成的薄膜。在另外的其它实施方案中，所述基材可以是不透液体但能够渗透气体和水蒸汽(即，透气的)的。材料的"透气性，，以水蒸汽传递速率(WVTR)的方法来计量，较高的值意味着较多的透气材料而较低的值意味着较少的透气材料。透气材料可以，例如，具有至少约100克每平方米每24小时(g/m2/24小时)的水蒸汽传递速率(WVTR),在一些实施方案中从约500到约20,000g/m2/24小时，而在一些实施方案中从约1,000到约15,000g/m"24小时。透气材料通常可以由本领域/>知的各种材料形成。例如，透气材料可以包含透气薄膜，例如多微孔的和单片薄膜。可以使用各种公知的涂敷技术将指示剂涂敷到基材上。合适的涂敷技术包括印刷、浸涂、喷雾、熔融挤出、溶剂涂布和粉末涂布等等。可以将指示剂混入基材的基质内部和/或包含在其表面之上。例如，在一个实施方案中，将指示剂涂布到基材的一个或多个表面上。在一个具体实施方案中，使用印刷技术，例如胶版印刷、照相凹版印刷、丝网印刷或墨喷印刷，将指示剂涂层印刷到基材上。这样的印刷技术的多个例子描述于Levy等人的美国专利No.5,853,859和Lye等人的美国专利申请/>开No.2004/0120904中，在此将它们的全文引入并为了所有目的作为参考。如果需要求，可以将所述指示剂施加到基材的一个或多个不同的区;或更多个不同"指示剂区域(例如:线、点等)来检测两;或更多种微生物的存在。在一个具体实施方案中，使用四个不同指示剂区域来检测大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单细胞菌的存在。以这种方式，用户可以简单地〗現测不同的区域乂人而确定哪种4鼓生物存在。虽然指示剂区域通常可以被施加到基材的任何表面，但它们一般至少存在于能够在使用期间与由微生物产生的挥发性化合物接触的表面上。存在于基材上的指示剂的量可以根据基材的属性和其计划的应用、以及指示剂和挥发性化合物的属性等等而变化。例如，较低的添加水平可以提供最佳的基材官能性，而较高的添加水平可以提供最佳的检测灵敏度。然而，指示剂通常占基材的约0.001wt.Q/o到约10wt.%，在一些实施方案中乂人约0.01wt.。/。到约5wt.%，而在一些实施方案中从约0.05wt.。/。到约2wt.%。同样地，基材表面指示剂的百分比覆盖度可以选择性地改变。一般地，该百分比覆盖度小于给定表面面积的100%，在一些实施方案中小于约90%，而在一些实施方案中从约5%到约50%。在一些情况下，还可以使用高表面积粒子以增加基材的有效表面积，从而改善指示剂与挥发性化合物之间的接触。通常，高表面积粒子的表面积为从约50平方米每克(m2/g)到约1000m2/g，在一些实施方案中从约100m2/g到约600m2/g，而在一些实施方案中从约180m2/g到约240m2/。表面积可以通过Bruanauer,Emmet和Teller,JournalofAmericanChemicalSociety,第60巻，1938，第309页的物理气体吸附(B.E.T)方法用氮气作为吸附气体而确定。高表面积粒子也可以根据期望的结果而具有各种形式、形状和尺寸。例如，所述粒子的形状可以为球形、结晶、杆、盘、管、串等。粒子的平均尺寸通常小于约IOO纳米，在一些实施方案中从约1到约50纳米，在一些实施方案中从约2到约50纳米，而在一些实施方案中从约4到约20纳米。如在这里所使用的，粒子的平均尺寸是指其平均长度、宽度、高度和/或直径。另外，粒子也可以是相对无孔的或者是固体。也就是说，粒子可以具有小于约0.5毫升每克(ml/g)的孔隙容积，在一些实施方案中小于约0.4毫升每克，在一些实施方案中小于约0.3ml/g,而在一些实施方案中从约0.2ml/g到约0.3ml/g。高表面积粒子可以由各种材料形成，所述材料包括但不限于，二氧化硅，氧化铝，氧化锆，氧化镁，二氧化钛，氧化铁，氧化锌，氧化铜，有机化合物例如聚苯乙烯，及它们的组合。例如，可以使用氧化铝纳米粒子。一些合适的氧化铝纳米粒子描述于Ando等人的美国专利No.可商购获得的氧化铝纳米粒子的例子包括，例如，Aluminasol100,Aluminasol200和Aluminasol520，它《门可A人NissanChemicalIndustriesLtd.获得。替代性地，可以使用二氧化硅纳米粒子，例如Snowtex-C,Snowtex-O，Snowtex-PS和Snowtex-OXS，其也可从NissanChemical获得。Snowtex-OXS粒子，例如，具有从4到6纳米的粒径，并且可以被研磨成具有大约509平方米每克表面积的粉末。也可以使用氧化铝涂布的二氧化硅粒子，例如可由NissanChemical获得的Snowtex-AK。高表面积粒子，例如参考以上所述的，可以具有相连或不相连在一起的单元。这样的单元连接与否通常取决于聚合的条件。例如，当形成二氧化硅纳米粒子时，硅酸盐溶液的酸化可以产生Si(OH)4。如果该溶液的pH减小到低于7或者如果加入盐，那么单元可能倾向于熔合到一起呈链状而形成"二氧化硅凝胶"。另一方面，如果pH保持在中性的pH或高于7,单元可能倾向于分离并逐渐生长形成"二氧化硅溶胶"。这样的胶态二氧化硅纳米粒子通常可以根据本领域公知的各种技术中的任合技术形成，例如渗析、电渗析、胶溶、酸中和以及离子交换。这样的工艺的一些例子描述于例如Watanabe等人的美国专利No.5,100,581;Watanabe等人的美国专利No.5,196,177;Tsugeno等人的美国专利No.5,230,953以及Yamada等人的美国专利No.5,985,229中，在此将它们的全文引入并为了所有目的作为参考。在一个具体实施方案中，使用离子交换技术形成二氧化硅纳米粒子溶胶。仅为了示例性的目的，现在更加详细地描述一种这样的离子交换技术。首先，提供硅(Si02)与碱金属(M20)的摩尔比为约0.5到约4.5的碱金属硅酸盐。例如，可以使用摩尔比为从约2到约4的水玻璃钠。碱金属硅酸盐的水溶液是通过将其以例如从约2wt.y。到约6wt.%的浓度溶于水而获得。然后可以将含有碱金属硅酸盐的水溶液与一种或多种离子交换树脂接触。例如，可以将所述溶液首先与强酸接触以离子-交换水溶液中的全部金属离子。这样强酸的例子包括，但不限于，盐酸、硝酸和硫酸等等。所述接触可以通过在从约0。C到约60。C的温度下，在一些实施方案中在从约5。C到约5(TC下，使水溶液通过填充了强酸的柱子而完成。在通过柱子之后，所产生的含有硅酸的水溶液可以具有从约2到约4的pH值。如果需要，可以向含有硅酸的水溶液中加入另一种强酸从而将杂质金属组分转化成解离的离子。这种另外的强酸可以将所产生的溶液的pH值减小到小于约2,在一些实施方案中为从约0.5到约1.8。来自强酸的金属离子和阴离子可以通过连续应用强酸(即，阳离子交换树脂)和强碱(阴离子交换树脂)而从溶液中除去。合适的强碱的例子包括，但不限于，氢氧化钠和氢氧化钾等等。作为连续应用的结果，含有硅酸的水溶液的pH值可以为从约2到约5。然后可以将该酸性水溶液与一种或多种另外的强碱接触从而使溶液的pH值稳定在从约7到约9。接着将稳定的含有硅酸的水溶液供入到一个容器中，其中液体的温度维持在从约7(TC到约100。C。该过程导致二氧化硅的浓度增加到约30Wt。/。到约50Wt.%。然后可以将该稳定的含水二氧化硅溶"交连续地与强酸和强;成接触，所述强酸和强-威例如上面所描述的，以便使所产生的含水二氧化硅溶胶除了二氧化硅以外基本上不含多价金属氧化物。最后，可以向水溶胶中加入氨水以进一步使其pH值增加到约8到约10.5，由此形成二氧化硅浓度为从约30wt.。/o到约50wt.%,平均粒径为从约10到约30纳米，并且除了二氧化硅以外基本上不含有任何多价金属氧化物的稳定的含水二氧化硅溶胶。粒子的量通常可以根据基材的属性和其计划的应用而改变。例如，在一些实施方案中，干燥固体的加入水平为从约0.001%到约20%，在一些实施方案中为从约0.01%到约10%,而在一些实施方案中为从约0.1%到约4%。"固体加入水平"通过从处理的基材(干燥后)重量中减去未处理的基材重量，将该计算出的重量除以未处理的基材重量，然后乘以100%而确定。较低的加入水平可以提供最佳的基材官能性，而较高的加入水平可以提供挥发性化合物与指示剂之间的最佳接触。根据本发明，用指示剂带的颜色变化充当微生物存在的简单而快速的信号。其可能在多种应用中是有效的，包括在对食品安全、传染、气味等的评价中。例如，该指示剂带可以用作伤口护理覆盖物、食品包装、冷藏库、玩具、食品制备区域、医院区域、浴室区域、电话、计算机设备、卫生巾和尿布等等，或者与上述物质联合使用。如果需要，指示剂带还可以包括用于将所述带粘附到所需表面上的粘合剂(例如，压敏粘合剂、熔合粘合剂等等)。实施例1试验证明了鉴定一种或多种与特定种类细菌相关的挥发性化合物的能力。在本具体实施例中，测试了铜绿，支单细胞菌(P^mgz'"a^)(ATCC#9027)。通过使用tryticase大豆肉汤("TSB，，)溶液将1x108菌落数(cfu)每毫升(ml)的微生物原料稀释到1x105cfu/ml的浓度，从而制备铜绿假单细胞菌的悬浮液。将一毫升该悬浮液涂布到葡萄糖沙氏(DextroseSabouraud)琼脂板上，并使其在35。C下生长4小时。通过将铜绿假单细胞菌悬浮液置于250毫升隔板瓶(septa-jar)中并用铝箔-线形聚四氟乙烯/硅酮帽密封来制备样品。为了对照的目的，还制备了营养空白。将测试和对照样品暴露于85-微米CarboxenTM/聚二甲基硅氧烷"固相微萃取，，(SPME)装置中约30分钟以收集用于分析的挥发物。(Supelco目录编号"330-U手动纤维固定器和StableFlex纤维上的57334-U85pmCarboxenTM/聚二曱基硅氧烷(polydimethylsilicone),它们被推荐用于气体和低分子量化合物)。气相色谱和质谱(GC/MS)分析使用由科罗拉多洛夫兰的AgilentTechnologies,Inc获得的序列名称为"5973N"的系统进行。将氦气作为载气(进样口压力12.7psig;供应管线压力为60psig)。使用长度为60米，内径为0.25毫米的DB-5MS柱。这样的柱子可以从加利福尼亚州福尔瑟姆的J&WScientific,Inc.获得。GC/MS系统使用的加热室和操作参数示于下表1和2中表1:GC/MS系统的加热室参数<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>将SPME萃取物热解吸并通过GC/MS分析离析物。所获得的铜绿假单细胞菌的总离子色谱显示于图2中。使用光谱中的质荷比和它们的相对丰度将光谱峰与相应的化合物进行匹配。光谱分析的结果示于下表3中表3:铜绿假单细胞菌的光i普分析<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如上所示，几个挥发性化合物被确定为与铜绿假单细胞菌相关，其包括烷基酯、含硫化合物和烯烃。实施例2利用实施例1的方法鉴定由金黄色葡萄球菌(5*.鼎rei^)(ATCC#6538)产生的挥发性化合物。所获得的金黄色葡萄球菌的总离子色谱显示于图3中。使用光谱中的质荷比和它们的相对丰度将光谱峰与相应的化合物进行匹配。仅有两个化合物显示了在浓度上基本大于营养空白的峰。这两个化合物被确定为下表4中的化合物。表4:金黄色葡萄球菌的光谱分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如上所示，被确定为与金黄色葡萄球菌相关的挥发性化合物包括噻唑和烯烂。实施例3利用实施例1的方法鉴定由大肠杆菌(Eco/O(ATCC#8739)产生的挥发性化合物。所获得的大肠杆菌的总离子色谱显示于图4中。使用光谱中的质荷比和它们的相对丰度将光谱峰与相应的化合物进行匹配。仅有三个化合物显示了在浓度上基本大于营养空白的峰。这三个化合物被确定为下表5中的化合物。表5:大肠杆菌的光谱分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如上所示，被确定为与大肠杆菌相关的挥发性化合物包括醇、烯烃和稠杂环化合物。实施例4利用实施例1的方法鉴定由白色念珠菌(C.a/6,cam')(ATCC#10231)产生的挥发性化合物。所获得的白色念珠菌的总离子色谱显示于图5中。使用光谙中的质荷比和它们的相对丰度将光语峰与相应的化合物进行匹配。化合物:帔确定为下表6中的化合物。表6:白色念珠菌的光谦分析<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如上所示，被确定为与白色念珠菌相关的挥发性化合物包括醛、醇、杂环化合物和含好L化合物。实施例5利用实施例1的方法鉴定由猪霍乱沙门氏菌(Sa/wo"e〃ac/zo/era&s'zm')产生的挥发性化合物。所获得的猪霍乱沙门氏菌的总离子色谱显示于图6-7中。使用光i普中的质荷比和它们的相对丰度将光谱峰与相应的化合物进行匹配。化合物被确定为下表7中的化合物。表7:猪霍乱沙门氏菌的光谱分析<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如上所示，被确定为与猪霍乱沙门氏菌相关的挥发性化合物包括醇和杂环化合物。实施例6分析实施例1-5所获得的结果以确认与铜绿假单细胞菌(革兰氏阴性)、大肠杆菌(革兰氏阴性)、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)、白色念珠菌(酵母)和猪霍乱沙门氏菌(革兰氏阴性)相关的一种或多种挥发性化合物。铜绿假单细胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生1-十一碳烯。但是，这些细菌其余的挥发特征明显地不同。铜绿假单细胞菌产生一系列的惕各酸酯、硫化合物以及小支链酸的酯。金黄色葡萄球菌具有较简单的挥发特征，仅有两个化合物与营养空白相比具有明显较大的浓度。其最主要的峰是2-乙酰基噻唑。另外，大肠杆菌挥发物仅包含三个其浓度明显大于营养空白的化合物。吲哚是主峰。白色念珠菌的挥发特征明显不同于铜绿假单细胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的挥发物。在输送对照和媒介对照二者中存在多种杂质峰使得难以确定什么化合物是猪霍乱沙门氏菌释放气体中的最主要的物质。然而，在猪霍乱沙门氏菌培养物中主要发现的一些化合物包括异丙醇、2,5-二曱基吡嗪、乙醇以及可能的3-曱基-1-丁醇和环己烷。基于以上所述，如下挥发性化合物;故确^人微生物挥发性化合物大肠軒菌吲哚金黄色葡萄球菌2-乙酰基p塞唑铜绿假单细胞菌2-曱基-2-丁烯酸甲酯白色念珠菌异戊醇猪霍乱沙门氏菌2,5-二曱基吡唤下一步是要确定对微生物的挥发物灵敏的变色染料，将所述染料作为产生微生物存在可视指示剂的手段。表8列出了对特定挥发性化合物灵敏的染料，它们在暴露于极低的目标化合物浓度下时也能发生颜色变化。表8:鉴定挥发性化合物的变色染料<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>当暴露于挥发性化合物中时，所选择的染料在溶液相中迅速地变色。表9列出了当染料与典型化合物反应时观察到的颜色变化。表9:由挥发性化合物引起的可视颜色变化<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如上所示，所述染料充当了鉴定挥发性化合物的有效指示剂。实施例7试验证明了当存在于气相时，实施例6中所选择的染料与各自的挥发性化合物的反应能力。具体地说，通过利用Pasture滴管将每种染料的溶液(将40毫克染料溶于IO毫升的丙酮或水中)等分分配，将等分分配的溶液涂布到小基材带上。每个基材都用SnowtexTM(3XS二氧化硅纳米粒子预处理并且将其空气干燥。所述二氧化硅纳米粒子增加了带的表面积，从而增加了染料在挥发性化合物中的暴露量。表IO反映了所使用的具体溶剂和基材。表10:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>测试是通过将染料涂布带暴露于每种微生物特有的挥发性化合物的顶部空间而进行的。具体来说，将染料涂布带悬浮于小瓶中以免接触到瓶底的液体。在每种情况下，在暴露于挥发性化合物的1分钟之内观察颜色的变化。还使用活的大肠杆菌细菌悬浮液进行"真实环境测试(realworldtest)，，。将存活的细菌悬浮液(100微升)置于闪烁管中并且将一条染料涂布棉织物带悬挂到小瓶的顶端。旋上盖子后，在l分钟之内观察到颜色变化。当仅使用生长培养基重复相同的实验时不发生颜色变化。因此，该指示剂染料能够清楚地鉴定大肠杆菌的存在。虽然根据其具体实施方案本发明已经被详细地描述，但可以预见，通过对上下文的理解，本领域技术人员可以容易地想到这些实施方案的变化、演变以及等价物。因此，本发明的范围应当被确定为所附的权利要求及其任何等价物的范围。权利要求1、一种检测微生物存在的方法，该方法包括萃取由微生物培养所产生的顶隙气体；分析所萃取的顶隙气体并且鉴定与微生物培养相关的挥发性化合物；和选择在所鉴定的挥发性化合物的存在下能够呈现可检测颜色变化的指示剂。2、一种检测微生物存在的方法，该方法包括鉴定与微生物培养相关的挥发性化合物；选择在所鉴定的挥发性化合物的存在下能够呈现可检测颜色变化的指示剂；和将该指示剂涂敷到基材表面上。3、如权利要求2所述的方法，其进一步包括将另外的指示剂涂敷到基材的表面，所述另外的指示剂在另外的挥发性化合物的存在下能够呈现可检测的颜色变化，所述另外的挥发性化合物与另外的微生物培养相关。4、如权利要求2或3所述的方法，其进一步包括将基材表面与由微生物产生的挥发性化合物相接触。5、如权利要求2、3或4所述的方法，其中所述挥发性化合物是通的。—乂、'"—、'6、如权利要求1或5所述的方法，其中使用固相微萃取来萃取所述的顶隙气体。7、如权利要求l、5或6所述的方法，其进一步包括将所萃取的顶隙气体与气相色谱的色谱柱相接触以分离顶隙气体的一种或多种组分。8、如权利要求l、5、6或7所述的方法，其进一步包括将顶隙气体的分离组分供入到质谱仪中从而产生质谱。9、如上述权利要求任意一项所述的方法，其中所述微生物是细菌。10、如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是铜绿假单细胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌或猪霍乱沙门氏菌。11、如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是铜绿假单细胞菌，并且所鉴定的挥发性化合物是2-曱基-2-丁烯酸曱酯。12、如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌，并且所鉴定的挥发性化合物是吲哚。13、如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是金黄色葡萄球菌，并且所鉴定的挥发性化合物是2-乙酰基噻唑。14、如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是白色念珠菌，并且所鉴定的挥发性化合物是异戊醇。15、如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是猪霍乱沙门氏菌，并且所鉴定的挥发性化合物是2,5-二曱基吡。秦。16、如上述权利要求的任意一项所述的方法，其中所述指示剂是高锰酸钾、二曱氨基肉桂醛、2,4-二硝基苯肼或重铬酸铵。17、一种用于检测多种微生物存在的基材，所述基材含有至少的第一和第二指示剂区域，其中第一指示剂包含于第一指示剂区域内，其含量为当与第一微生物产生的第一挥发性化合物相接触时能产生可检测颜色变化的有效量，并且其中第二指示剂包含于第二指示剂区域内，其含量为当与第二微生物产生的第二挥发性化合物相接触时能产生可检测颜色变化的有效量。18、如权利要求17所述的基材，其中第一和第二挥发性化合物选自2-曱基-2-丁烯酸甲酯、口引哚、2-乙酰基噻唑、异戊醇和2，5-二曱基吡嗪。19、如权利要求17或18所述的基材，其中第一和第二指示剂选自高锰酸钾、二曱氨基肉桂醛、2,4-二硝基苯肼和重铬酸铵。20、如权利要求17到19任意一项所述的基材，其中每种指示剂以占所述基材约0.001wt.%到约10wt.%的量存在。21、如权利要求17到20任意一项所述的基材，其中所述基材进一步包含高表面积粒子。全文摘要本发明提供了一种以简单、快速并且有效的方式检测微生物存在的技术。更具体地说，该技术涉及鉴定与所关心的特定微生物相关的一种或多种挥发性化合物。所述挥发性化合物可以例如使用固相微萃取结合气相色谱/质谱(“GC/MS”)分析方法而被鉴定。一旦鉴定，接着就可以选择指示剂，所述指示剂被设定成在存在所鉴定的挥发性化合物(化合物们)时其能够呈现可检测的颜色变化。如果需要，可以在基材上提供所述指示剂以形成用于各种应用的指示剂带。以这样的方式，微生物的存在可以通过简单地观察指示剂带的颜色变化而被迅速地检测。文档编号G01N33/52GK101151530SQ200680010844公开日2008年3月26日申请日期2006年1月19日优先权日2005年3月30日发明者J·G·麦唐纳,R·A·博尔德斯申请人:金伯利-克拉克环球有限公司