用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及食品微生物检测技术领域，特别是一种涉及用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

克罗诺杆菌(cronobacterspp.)原名为阪崎肠杆菌，可以通过污染婴幼儿奶粉而引起新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和败血症等，严重可导致死亡或预后留有神经系统后遗症、发育障碍。虽然早在1958年就有感染病例，但一直被误认为是阴沟肠杆菌,直到1980年才被正式命名为阪崎肠杆菌。2008年，艾弗森(iversen)等人将原来的阪崎肠杆菌，大肠杆菌科里的一个“种”，重新划分为一个“属”，并命名为克罗诺杆菌属。到目前为止，研究报道“属”内一共分有7个“种”，分别为阪崎克罗诺杆菌(c.sakazakii)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(c.malonaticus)、穆汀斯克罗诺杆菌(c.muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌(c.dublinensis)、苏黎世克罗诺杆菌(c.turicensis)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(c.universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(c.condimenti)，其中，常见的为前五种。

2011年克鲁兹(cruz)等人将不同“种”克罗诺杆菌的菌株进行了细胞粘附和侵袭实验，发现不同“种”克罗诺杆菌的菌株表现的细胞毒性有差异；再者，分子流行病学研究结果也表明不同“种”克罗诺杆菌的不同基因型(sequencetypes，sts)的菌株可能具有不同的致病力，例如st4的阪崎克罗诺杆菌(c.sakazakii)是引起新生儿脑膜脑炎主要型别。因此，在“属”水平对各个“种”进行区分并鉴定在目前克罗诺杆菌研究中尤为重要。

传统的分种方法依赖于生理生化和形态学特点，但是这种方法操作繁琐、耗时长、不易分辨结果，而且存在一定假阳性情况，所以逐渐被淘汰。随着分子生物学技术的成熟发展，分子检测的方法被广泛应用。

2009年stoop等利用普通pcr方法进行了克罗诺杆菌属内各个“种”的鉴定，该方法选用rpob基因作为目标检测基因，然而由于阪崎克罗诺杆菌(c.sakazakii)和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(c.malonaticus)的rpob基因具有高同源性，因此还需要再设计一对引物才能将两者区别。huangch等利用dna促旋酶b亚基基因设计引物，建立了一种只能用于区别阪崎克罗诺杆菌(c.sakazakii)和都柏林克罗诺杆菌(c.dublinensis)的普通pcr检测方法。caixianquan等利用外膜蛋白基因ompa基因建立了针对克罗诺杆菌属的荧光定量pcr方法，在荧光定量pcr反应结束后对pcr产物进行高分辨率溶解曲线的生成，根据溶解曲线的差异从而将克罗诺杆菌属内不同“种”的菌株区别。stephan等利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof)质谱鉴定方法将克罗诺杆菌属菌株鉴定到“种”的水平，还有多位点序列分型(mlst)通过测序并将将序列进行分析后，也可以鉴定各个“种”。

但是上述方法或流程比较多，成本比较高，或者缺乏直观判定性，或鉴定周期长，因此均未能得到广泛的应用。

技术实现要素：

基于此，有必要针对鉴定成本高、流程繁琐、无法直观判定克罗诺杆菌属各个“种”的方法，提供一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法。

本发明提供的一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组，所述克罗诺杆菌属各个“种”包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，其中，所述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组包括第一引物对、第二引物对以及第三引物对；

所述第一引物对的序列分别如seqidno.s1和2所示；

所述第二引物对的序列分别如seqidno.s3和4所示；

所述第三引物对的序列分别如seqidno.s5和6所示。

本发明提供的一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的探针，所述克罗诺杆菌属各个“种”包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，其中，所述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的探针包括第一探针、第二探针以及第三探针；

所述第一探针的序列如seqidno.s7所示；

所述第二探针的序列如seqidno.s8所示；

所述第三探针的序列如seqidno.s9所示。

本发明提供的一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒，所述克罗诺杆菌属各个“种”包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，其中，所述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒包括用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组以及用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的探针；

所述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组包括第一引物对、第二引物对以及第三引物对；

所述第一引物对的序列分别如seqidno.s1和2所示；

所述第二引物对的序列分别如seqidno.s3和4所示；

所述第三引物对的序列分别如seqidno.s5和6所示；

所述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的探针包括第一探针、第二探针以及第三探针；

所述第一探针的序列如seqidno.s7所示；

所述第二探针的序列如seqidno.s8所示；

所述第三探针的序列如seqidno.s9所示。

在其中一个实施例中，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对在工作液中的浓度分别为10±1μmol/l，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针的工作液探针浓度分别为10±1μmol/l。

在其中一个实施例中，还包括10×premixextaq缓冲液以及roxii矫正染料。

在其中一个实施例中，还包括分别由所述第一引物对、所述第二引物对以及所述第三引物对扩增片段并放入载体质粒得到的第一标准品、第二标准品、第三标准品。

本发明提供的一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的方法，所述克罗诺杆菌属各个“种”包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，其中，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)的基因组dna为反应体系的模板，以序列如seqidno.s1和2所示的第一引物对、以序列如seqidno.s3和4所示的第二引物对、以序列如seqidno.s5和6所示的第三引物对为反应体系的引物，以序列如seqidno.s7所示的第一探针、以序列如seqidno.s8所示的第二探针、以序列如seqidno.s9所示的第三探针为反应体系的探针进行扩增反应；

(3)结合待测样品扩增曲线判定鉴定结果。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：

(1’)分别配制梯度浓度的第一标准品溶液、第二标准品溶液、第三标准品溶液，其中，所述第一标准品、所述第二标准品、所述第三标准品分别由所述第一引物对、所述第二引物对以及所述第三引物对扩增片段并放入载体质粒得到的；

(2’)分别以梯度浓度的所述第一标准品溶液、所述第二标准品溶液、所述第三标准品溶液为反应体系的模板，以序列如seqidno.s1和2所示的第一引物对、以序列如seqidno.s3和4所示的第二引物对、以序列如seqidno.s5和6所示的第三引物对为反应体系的引物，以序列如seqidno.s7所示的第一探针、以序列如seqidno.s8所示的第二探针、以序列如seqidno.s9所示的第三探针为反应体系的探针进行扩增反应；

(3’)结合所述第一标准品、所述第二标准品、所述第三标准品标准品的扩增曲线分别绘制第一标准品曲线、第二标准品曲线以及第三标准品曲线；

(4)根据待测样品扩增曲线、第一标准品曲线、第二标准品曲线以及第三标准品曲线对待测样品进行定量分析。

在其中一个实施例中，所述扩增反应的程序包括：

在95℃下2min，1个循环；

在95℃下15s，40个循环；

在60℃下30s，40个循环。

在其中一个实施例中，所述反应体系总体积为20μl，所述反应体系包括：

10×premixextaq缓冲液10μl；

roxii矫正染料0.4μl；

模板2μl；

所述序列如seqidno.s1所示的引物0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s2所示的引物0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s3所示的引物0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s4所示的引物0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s5所示的引物0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s6所示的引物0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s7所示的探针0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s8所示的探针0.3μl至1μl；

所述序列如seqidno.s9所示的探针0.3μl至1μl；

水余量。

上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组和探针，针对克罗诺杆菌属各个“种”中的阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌基因序列特征进行特异性设计，能够一次性区分鉴定出阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，检测灵敏度高，可确保结果的准确性，鉴定快速、成本低，能够进行广泛的应用。

上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒，利用上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对和探针，能够一次性区分鉴定出阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，检测灵敏度高，可确保结果的准确性，鉴定快速、成本低，能够进行广泛的应用。

上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的方法，利用上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对和探针，能够一次性区分鉴定出阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，检测灵敏度高，可确保结果的准确性，鉴定快速、成本低，能够进行广泛的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1待测样品的扩增曲线图；

图2为本发明实施例1待测样品基于第一探针的扩增曲线图；

图3为本发明实施例1待测样品基于第二探针的扩增曲线图；

图4为本发明实施例1待测样品基于第三探针的扩增曲线图；

图5为本发明实施例6待测样品基于第一探针的扩增曲线图；

图6为本发明实施例6待测样品基于第二探针的扩增曲线图；

图7为本发明实施例6待测样品基于第三探针的扩增曲线图；

图8为本发明第一标准曲线图；

图9为本发明第二标准曲线图；

图10为本发明第三标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组和探针，利用该引物对组和探针能够一次性鉴定克罗诺杆菌属中包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌在内的五个具体的菌种。

上述引物对组包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，上述探针包括第一探针、第二探针和第三探针。

参考美国国家生物技术信息中心dna序列数据库克罗诺杆菌16srrna基因序列，将阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌与其他“种”相比，找到核苷酸序列碱基缺失的目标位点，设计第一探针和第一引物对，其中将第一探针5’端用hex荧光标记，名称记为csm-ctd-p，第一引物对的上下游引物名称分别记为csm-ctd-f和csm-ctd-r。

参考美国国家生物技术信息中心dna序列数据库克罗诺杆菌fusa基因序列，找到阪崎克罗诺杆菌与丙二酸盐阳性克罗诺杆菌碱基不同的位点,设计第二探针和第二引物对，其中，将第二探针5’端用fam荧光标记，名称记为cs-cma-p，第一引物对的上下游引物名称分别记为cs-cma-f和cs-cma-r。

同样参考美国国家生物技术信息中心dna序列数据库克罗诺杆菌fusa基因序列，找到穆汀斯克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌碱基不同的位点,设计第三探针和第三引物对，其中，将第三探针5’端用cy5荧光标记，名称记为cmu-cd-p，第三引物对的上下游引物名称分别记为cmu-cd-f和cmu-cd-r。

具体地，第一引物对、第一探针，第二引物对、第二探针，第三引物对、第三探针的序列如表1所示。

表1引物对及探针序列

其中，产物长度指的是有分别由第一引物对、第二引物对、第三引物对扩增后的产物长度。

本发明提供了一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒，能够一次性鉴定克罗诺杆菌属中包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌在内的5个具体的菌种。

作为一种可选实施方式，该用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒包括用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组和用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的探针。其中，用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组包括上述第一引物对、第二引物对和第三引物对，用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的探针包括上述第一探针、第二探针和第三探针。

可选地，上述第一引物对、第二引物对、第三引物对工作液中引物浓度分别为10±1μmol/l。即csm-ctd-f工作液中csm-ctd-f的浓度为10±1μmol/l，csm-ctd-r工作液中csm-ctd-r的浓度为10±1μmol/l，cs-cma-f工作液中cs-cma-f的浓度为10±1μmol/l，cs-cma-r工作液中cs-cma-r的浓度为10±1μmol/l，cmu-cd-f工作液中cmu-cd-f的浓度为10±1μmol/l，cmu-cd-r工作液中cmu-cd-r的浓度为10±1μmol/l。

可选地，上述第一探针、第二探针、第三探针工作液中探针浓度分别为10±1μmol/l。即csm-ctd-p工作液中csm-ctd-p的浓度为10±1μmol/l，cs-cma-p工作液中cs-cma-p的浓度为10±1μmol/l，cmu-cd-p工作液中cmu-cd-p的浓度为10±1μmol/l。

作为一种可选实施方式，上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒还包括10×premixextaq缓冲液以及roxii矫正染料。

作为一种可选实施方式，上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的试剂盒还包括分别由第一引物对、第二引物对以及第三引物对扩增得到的第一标准品、第二标准品以及第三标准品。

可选地，上述第一标准品、第二标准品以及第三标准品的制备方法如下：

第一步，普通pcr分别对引物对扩增得到目的基因，其中引物对指上述第一引物对、第二引物对以及第三引物对中的任意一种。

第二步，跑电泳回收上述目标基因(qiagen胶回收试剂盒)。

第三步，将目的基因连接到载体上，pmd19-tvector2ul，insertdna8ul，总量为10μl。加入10μl(等量)的solutioni(冰中溶解)，16℃反应2h，制得重组质粒。

第四步，将第三步中的重组质粒导入感受态细胞(-80℃)。takarae.colijm109competentcells使用前在冰上融化。轻微混合，将100μl细胞移入1.5ml离心管。第三步中全量(20μl)加入至100μljm109感受态细胞中，冰中放置30分钟，42℃放置90秒，冰中放置1-2分钟，添加soc培养基(预先在37℃保温)至终体积1ml，37℃振荡培养1小时(160-225rpm)。取适量培养液涂于蓝白筛选培养基(平板使用前需在37℃预热30分钟，翻转避光培养)。

第五步，37℃过夜培养，蓝白色菌落筛选(添加x-gal,iptg,amp)，制得克隆目的片段。进一步地，普通pcr方法验证克隆目的片段的大小，当测序结果与目的基因序列比对一致后，确认制得对应的模板标准品。本发明提供了一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的方法，能够一次性鉴定克罗诺杆菌属中包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌在内的五个具体的菌种。

具体地，上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)的基因组dna为反应体系的模板，以上述第一引物对、第二引物对、第三引物对为反应体系的引物，以上述第一探针、第二探针、第三探针为反应体系的探针进行扩增反应；

(3)结合待测样品扩增曲线图判定鉴定结果。

进一步地，扩增反应为聚合酶链式反应(pcr)。

可选地，步骤(3)中结合待测样品扩增曲线图判定鉴定结果的方法如下：

将待测样品基于不同探针的测定ct值与预设ct值进行比较，当测定ct值＞预设测定ct值时判定为阴性，当测定ct值≤预设ct值时判定为阳性。可选的，预设ct值为35。

将判定结果与表2比对，从而可以鉴定待测样品中的克罗诺杆菌属的具体的“种”。

表2克罗诺杆菌属各个“种”对探针的反应结果

其中，“+”代表阳性，即测定ct值≤预设测定ct值，“-”代表阴性，即测定ct值＞预设测定ct值。

该方法能够直观地鉴定待测样品中克罗诺杆菌属内具体的种，检测快速、准确、直观、廉价。

作为一种可选实施方式，上述用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的方法还包括以下步骤：

(1’)分别配制梯度浓度的第一标准品溶液、第二标准品溶液、第三标准品溶液；

(2’)分别以梯度浓度的第一标准品溶液、第二标准品溶液、第三标准品溶液为反应体系的模板，以上述第一引物对、第二引物对、第三引物对为反应体系的引物，以上述第一探针、第二探针、第三探针为反应体系的探针进行扩增反应；

(3’)结合第一标准品、第二标准品、第三标准品的扩增曲线分别绘制第一标准曲线、第二标准曲线以及第三标准曲线；

(4)根据待测样品扩增曲线、第一标准曲线、第二标准曲线以及第三标准曲线对待测样品进行定量分析。

可选地，根据标准曲线换算成拷贝数，计算测待测样品浓度其中拷贝数的换算公式如下：

拷贝数(copies/ul)＝(6.02x10²³)x(g/ulx10^-9)/(质粒长度x660)

待测样品通过荧光定量pcr方法扩增后可获得ct值，在标准曲线上找到对应的ct值并通过上述换算公式换算为核酸的拷贝数，然后再计算其真实质量。进一步地，通过引入第一标准品、第二标准品、第三标准品并绘制标准曲线，能够对待测样品中克罗诺杆菌属各个“种”进行定量分析，提高该方法的应用价值。

作为一种可选实施方式，上述扩增反应程序包括：

在95℃下2min，1个循环；

在95℃下15s，40个循环；

在60℃下30s，40个循环。

作为一种可选实施方式，所述反应体系总体积为20μl，反应体系包括：

实施例1

敏感性检测试验，待测样品为阪崎克罗诺杆菌(atcc29544)纯菌。

(1)提取待测样品的基因组dna。

将阪崎克罗诺杆菌纯菌在lb液体培养基中过夜培养，调菌液od值至1.0，10倍梯度稀释制备10¹-10⁷cfu/ml的菌液各1ml，用核酸提取试剂盒提取基因组dna，制得梯度浓度的待测样品基因组dna。

(2)取10×premixextaq缓冲液10μl，取csm-ctd-f工作液、csm-ctd-r工作液、cs-cma-f工作液、cs-cma-r工作液、cmu-cd-f工作液、cmu-cd-r工作液、csm-ctd-p工作液、cs-cma-p工作液、cmu-cd-p工作液各0.5μl，roxii矫正染料0.4μl，分别取10¹-10⁷cfu/ml的菌液提取的基因组dna2μl，纯水补充至20μl，制得总体积为20μl的反应体系，利用abi7500-fast荧光定量pcr仪进行扩增。

扩增反应程序如下：

在95℃下2min，1个循环；

在95℃下15s，40个循环；

在60℃下30s，40个循环。

(3)结合扩增曲线图判定鉴定结果。

请参阅图1所示，为实施例1的待测样品-阪崎克罗诺杆菌纯菌的扩增曲线图，将阪崎克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值进行比较，当测定ct值≤预设测定ct值时判定为阳性，当测定ct值＞预设ct值时判定为阴性。本实施例中，预设ct值为35。

本实施例的待测样品基于第一探针、第二探针、第三探针的判定结果均为阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品为阪崎克罗诺杆菌。

请参阅图2至图4所示，分别为实施例1不同梯度浓度待测样品-阪崎克罗诺杆菌纯菌对第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图。

基于图2至图4所示的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对阪崎克罗诺杆菌检测下限均为10²cfu/ml。

实施例2

采用与实施例1相同的方法检测待测样品-丙二酸盐阳性克罗诺杆菌纯菌，将丙二酸盐阳性克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阳性、阴性、阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌。

实施例2不同梯度浓度待测样品-丙二酸盐阳性克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对丙二酸盐阳性克罗诺杆菌检测下限均为10²cfu/ml。

实施例3

采用与实施例1相同的方法检测待测样品-穆汀斯克罗诺杆菌纯菌，将穆汀斯克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阴性、阴性、阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品为穆汀斯克罗诺杆菌。

实施例3不同梯度浓度待测样品-穆汀斯克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对穆汀斯克罗诺杆菌检测下限均为10²cfu/ml。

实施例4

采用与实施例1相同的方法检测待测样品-都柏林克罗诺杆菌纯菌，将都柏林克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阴性、阴性、阴性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品为都柏林克罗诺杆菌。

实施例4不同梯度浓度待测样品-都柏林克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对都柏林克罗诺杆菌检测下限均为10²cfu/ml。

实施例5

采用与实施例1相同的方法检测待测样品-苏黎世克罗诺杆菌纯菌，将苏黎世克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阴性、阴性、阴性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品为苏黎世克罗诺杆菌。

实施例5不同梯度浓度待测样品-苏黎世克罗诺杆菌纯菌基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对苏黎世克罗诺杆菌检测下限均为10²cfu/ml。

实施例6

敏感性检测试验，待测样品为阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉。

(1)提取待测样品的基因组dna。

取2g婴儿配方奶粉溶于18ml灭菌生理盐水中，配成1：10的稀释液。分别吸取浓度为10¹-10⁷cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌(atcc29544)纯菌菌悬液1ml，加至9ml奶粉溶液中，充分混匀，制成阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉溶液。

分别取10ml上述阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉溶液以12000rpm离心1min，弃去上清，用1ml无菌水溶解菌体沉淀。此溶解液作为待测样品的初始液。向溶解液中分别加1ml无水乙醇，1ml氨水，1ml石油醚，混匀。混合物以12000rpm离心10min。弃去上清液，剩余的沉淀分别用1mlte(ph7.8)溶解，将其转移到1.5ml离心管，用核酸提取试剂盒提取dna，制得梯度浓度的待测样品基因组dna。

(2)取10×premixextaq缓冲液10μl，取csm-ctd-f工作液、csm-ctd-r工作液、cs-cma-f工作液、cs-cma-r工作液、cmu-cd-f工作液、cmu-cd-r工作液、csm-ctd-p工作液、cs-cma-p工作液、cmu-cd-p工作液各0.5μl，roxii矫正染料0.4μl，分别取10¹-10⁷cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉提取的待测样品基因组dna2μl，纯水补充至20μl，制得总体积为20μl的反应体系，利用abi7500-fast荧光定量pcr仪进行扩增。

扩增反应程序如下：

在95℃下2min，1个循环；

在95℃下15s，40个循环；

在60℃下30s，40个循环。

(3)结合扩增曲线图判定实验结果。

将阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉溶液基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值进行比较，当测定ct值≤预设测定ct值时判定为阳性，当测定ct值＞预设ct值35时判定为阴性。本实施例中，预设ct值为35。

本实施例的阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的判定结果均为阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品中含有阪崎克罗诺杆菌。

请参阅图8至图10所示，分别为实施例6不同梯度浓度阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉对第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图。

基于图8至图10所示的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对阪崎克罗诺杆菌模拟污染奶粉检测下限均为10³cfu/ml。

实施例7

采用与实施例6相同的方法检测待测样品-丙二酸盐阳性克罗诺杆菌模拟污染奶粉，将丙二酸盐阳性克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阳性、阴性、阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品含有丙二酸盐阳性克罗诺杆菌。

实施例7不同梯度浓度待测样品-丙二酸盐阳性克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对丙二酸盐阳性克罗诺杆菌模拟污染奶粉检测下限均为10³cfu/ml。

实施例8

采用与实施例6相同的方法检测待测样品-穆汀斯克罗诺杆菌模拟污染奶粉，将穆汀斯克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阴性、阴性、阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品中含有穆汀斯克罗诺杆菌杆菌。

实施例8不同梯度浓度待测样品-穆汀斯克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对穆汀斯克罗诺杆菌模拟污染奶粉检测下限均为10³cfu/ml。

实施例9

采用与实施例6相同的方法检测待测样品-都柏林克罗诺杆菌模拟污染奶粉，将都柏林克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阴性、阴性、阴性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品中含有都柏林克罗诺杆菌。

实施例9不同梯度浓度待测样品-都柏林克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对都柏林克罗诺杆菌模拟污染奶粉检测下限均为10³cfu/ml。

实施例10

采用与实施例6相同的方法检测待测样品-苏黎世克罗诺杆菌模拟污染奶粉，将苏黎世克罗诺杆菌模拟污染奶粉基于第一探针、第二探针、第三探针的测定ct值与预设ct值比较，判定结果分别为阴性、阳性、阳性，结合表2可知，鉴定结果确认待测样品中含有苏黎世克罗诺杆菌。

实施例10不同梯度浓度待测样品-苏黎世克罗诺杆菌模拟污染奶粉对第一探针、第二探针、第三探针的扩增曲线图，显示第一探针、第二探针、第三探针对苏黎世克罗诺杆菌模拟污染奶粉检测下限均为10³cfu/ml。

实施例11

特异性检测，待测样品包括311株克罗诺属的不同“种”的菌株，其中192株为阪崎克罗诺杆菌，64株为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌，14株为穆汀斯克罗诺杆菌，31株为都柏林克罗诺杆菌，10株为苏黎世克罗诺杆菌，其中均包含国际标准菌株。

采用与实施例1相同的方法测定上述待测样品，测定结果均与其实际菌种相对应。

实施例12

第一标准品制备：

第一步，普通pcr对第一引物对扩增得到目标基因。

第二步，跑电泳回收上述目标基因(qiagen胶回收试剂盒)。

第三步，将目的基因连接到载体上，pmd19-tvector2ul，insertdna8ul，总量为10μl。加入10μl(等量)的solutioni(冰中溶解)，16℃反应2h，制得重组质粒产物。

第四步，将第三步中的重组质粒导入感受态细胞(-80℃)。takarae.colijm109competentcells使用前在冰上融化。轻微混合，将100μl细胞移入1.5ml离心管。第三步中全量(20μl)加入至100μljm109感受态细胞中，冰中放置30分钟，42℃放置90秒，冰中放置1-2分钟，添加soc培养基(预先在37℃保温)至终体积1ml，37℃振荡培养1小时(160-225rpm)。取适量培养液涂于蓝白筛选培养基(平板使用前需在37℃预热30分钟，翻转避光培养)。

第五步，37℃过夜培养，蓝白色菌落筛选，(添加x-gal,iptg,amp)，制得克隆目的片段。进一步地，普通pcr方法验证克隆目的片段的大小，当测序结果与目的基因序列比对一致后，确认制得对应的第一标准品。

分别采用上述方法制备第二标准品以及第三标准品。

第一标准曲线制备：

(1’)分别配制梯度浓度的第一标准品溶液。

(2’)取10×premixextaq缓冲液10μl，取csm-ctd-f工作液、csm-ctd-r工作液、cs-cma-f工作液、cs-cma-r工作液、cmu-cd-f工作液、cmu-cd-r工作液、csm-ctd-p工作液、cs-cma-p工作液、cmu-cd-p工作液各0.5μl，roxii矫正染料0.4μl，分别取10¹-10⁷cfu/ml的第一标准品溶液2μl，纯水补充至20μl，制得总体积为20μl的反应体系，利用abi7500-fast荧光定量pcr仪进行扩增。

扩增反应程序如下：

在95℃下2min，1个循环；

在95℃下15s，40个循环；

在60℃下30s，40个循环。

(3’)结合第一标准品扩增曲线图绘制第一标准曲线，请参阅图8所示，为采用上述方法制得的第一标准曲线图。

分别采用上述方法制备第二标准曲线以及第三标准曲线，请参阅图9至图10所示，分别为采用上述方法制得的第二标准曲线图以及第三标准曲线图。

请参阅图8至图10所示，可以看出各梯度之间间隔的ct值相等，各梯度均能在一条直线上，标准曲线的相关系数在0.99以上，提示误差较小，可信度较高。

(4)根据待测样品扩增曲线、第一标准曲线、第二标准曲线以及第三标准曲线对待测样品进行定量分析。

根据标准曲线换算成拷贝数，计算测待测样品浓度。其中拷贝数的换算方式如下：

拷贝数(copies/ul)＝(6.02x10²³)x(ng/ulx10^-9)/(质粒长度x660)

在本发明描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>用于鉴定克罗诺杆菌属各个"种"的引物对、探针、试剂盒及方法

<130>jlp17110108bj

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>cronobacterspp.

<400>1

gtttatcaccggcagtctcctt22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>cronobacterspp.

<400>2

ctcgtgttgtgaaatgttgggt22

<210>3

<211>18

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<213>cronobacterspp.

<400>3

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<210>4

<211>22

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<213>cronobacterspp.

<400>4

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<210>5

<211>20

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<210>6

<211>20

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<210>8

<211>19

<212>dna

<213>cronobacterspp.

<400>8

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<210>9

<211>24

<212>dna

<213>cronobacterspp.

<400>9

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