专利名称：用于免疫测定的相位差正交干涉测量检测的方法和设备的制作方法
技术领域：
本申请主要涉及一种用于检测样品中特定生物材料的存在的设备，尤其涉及激光压缩系统，该激光压缩系统用于通过感测由于绑定在所述盘片上的靶受体的生物病原体和/或分析物引起的从所述盘片反射的探测光束的光学特性的变化而检测所述生物病原体和/或分析物的存在。
背景技术：
在许多化学、生物、医学和诊断专利申请中，都期望能检测样品中特定分子结构的存在。许多分子结构例如细胞、病毒、细菌、毒素、肽、DNA片段以及抗体均通过特殊的受体识别。包括基因芯片、免疫学芯片和用于检测癌细胞中的基因表达模式的DNA序列的生物化学技术，开拓了这些分子结构和受体间的相互作用。[实例参见下列论文的描述Sanders，G.H.W.和A.Manz发表在Trends in Anal.Chem.的2000年卷19(6)的364-378页上Chip-based microsystems for genomic and proteomic analysis；Wang，J.发表在Nucl.Acids Res.的2000年卷28(16)的3011-3016页上的From DNA biosensorsto gene chips；Hagman，M.发表在Science的2000年290卷的82-83页上的Doing immunology on a chip；Marx，J.发表在Science的2000年卷289的1670-1672页上的DNA Arrays reveal cancer in its many forms]。这些技术通常采用准备包含期望受体的固定芯片(所述受体在测试时与靶分析物或者分子结构相互作用)。由于所述受体面积可以很小，可以生产用于测试多个分析物的芯片。理想地，提供成千上万个结合受体以提供全面化验。当所述受体被暴露给生物样品时，只有少数可以结合特定的蛋白或者病毒。理想地，在尽可能短的时间内测定这些受体点。
一种被称为免疫压缩盘片的技术，用于筛分多个分子结构，其仅包括抗体微阵列。[实例参见下列论文的描述Ekins，R.、F.Chu和E.Biggart发表在Anal.Chim.Acta的1989年卷227的73-96页上的Development of microspotmulti-analyte ratiometric immunoassay using dual floursecent-labelledantibodies；Ekins，R.和F.W.Chu发表在Clin.Chem.的1991年卷37(11)的1955-1967页上的Multianalyte microspot immunoassay-Microanalytical“compact Disk”of the future；Ekins，R.发表在Clin.Chem.的1998年卷44(9)的2015-2030页上的Ligand assaysfrom electrophoresis to miniaturizedmicroaarays]。在测试时采用常规的荧光检测仪感测所述分子结构的微阵列的存在。其它免疫化验的方法采用包含波导和光栅耦合器的传统的Mach-Zender干涉仪。[实例参见下列论文的描述Gao，H等人发表在Biosensors and Bioelectronics的1995年卷10的317-328页上Immunosensingwith photo-immobilized immunoreagents on planar optical wave guides；Maisenholder，B.等人发表在Sensors and Actuators B的1997年卷38-39的324-329页上的A GaAs/AlGaAs-based refractometer platform for integratedoptical sensing applications；Kunz，R.E.发表在Sensors and Actuators B的1997年卷38-39的13-28页上的Miniature integrated optical modules for chemicaland biochemical sensing；Dübendorfer，J.和R.E.Kunz发表在Sensors andActuators B的1997年卷38-39的116-121页上的Reference pads for miniatureintegrated optical sensors；Brecht，A和G.Gauglitz发表在Sensors and ActuatorsB的1997年卷38-39的1-7页上的recent development in optical transducers forchemical or biochemical applications]。干涉测量光学生物传感器在干涉测量灵敏度方面具有固有的优点，但通常通过每个元件的大的表面积、长的互作用长度或者复杂的共振结构来表现。它们也可能由于热的或者机械影响而易于相位漂移。
当已证明上述技术在化学、生物、医学和诊断应用工业中对产生和读取化验信息有用时，可以预期在现有平面阵列技术应用中平面阵列的改进制造和读取技术的发展将有显著进步。
发明内容
根据本发明的一方面，提供一种检测生物样品中有无靶分析物的无标记相位差正交干涉测量方法。所述方法包括将基层的反射表面暴露给所述生物样品。所述反射表面具有受体分子覆盖层的空间图样。每一覆盖层特定于特殊的靶分析物。所述方法进一步包括使用分式光电检测器测量反射信号的远场衍射图样的强度。所述反射信号由聚焦探测激光束所产生，所述探测激光束的波长为λ，以腰斑半径ω0入射到受体分子覆盖层的空间图样上。所述反射信号也由扫描所述基层的至少一部分产生。所述方法进一步包括通过采用分式光电检测器测量两个观察角度的至少一个的强度来测量在基本正交条件下部分所述反射信号的强度。所述两个观察角度基本上等于一对正交角。所述正交角θq根据正交于基层的光线，通过公式θq＝sin-1(λ/2w0)定义。
根据本发明一方面的变化，在傅立叶平面中对反射光束的远场衍射图样的强度进行测量。
根据本发明一方面的另一变化，所述方法进一步包括将所述一对正交角中的一个角度上的分式光电检测器的输出反转，并将所述反转后的输出与所述一对正交角中的另一个角度上的分式光电检测器的输出相加。
根据本发明一方面的另一变化，所述方法进一步包括在使用所述分式光电检测器测量强度之前将所述反射信号通过物镜。
根据本发明一方面的另一变化，所述基层为盘片，并且通过旋转所述盘片而对所述基层进行扫描。
根据本发明的另一方面，提供一种正交干涉测量方法，该方法用于测定样品中是否存在靶分析物。所述方法包括使用波长为λ，腰斑半径为w0的激光束来探测至少部分基层。所述的部分基层具有暴露给所述样品的反射面。所述反射面包括至少第一区域和第二区域，所述第一区域具有特定于靶分析物的识别分子层，所述第二区域不包含特定于靶分析物的识别分子层。所述方法还进一步包括在探测所述第一区域和第二区域的同时，测量探测束的反射衍射信号的一对正交角θq中的一个角度上的基本仅第一正交的光电检测器上依赖时间强度。
根据本发明一方面的变化，所述时间依赖产生于入射激光束相对于所述基层的相对运动。
根据本发明一方面的另一变化，所述基层为盘片，所述盘片相对于入射激光束的相对运动是通过旋转所述盘片而产生。
根据本发明一方面的另一变化，使用分式光电检测器配置对所述激光束的反射衍射信号进行测量。所述方法进一步包括将对应于一对正交角中的一个角度的反射信号的第一输出部分进行反转。所述反转后的第一输出与对应于一对正交角中另一个角度的反射信号的第二输出相加。
根据本发明一方面的另一变化，所述基层是盘片，并且在测量强度前先将所述反射衍射信号通过物镜。
根据本发明一方面的另一变化，所述方法进一步包括在测量强度前先将所述探测光束的反射衍射信号通过π/2相位模板。
根据本发明一方面的另一变化，所述反射表面很平。所述正交角根据正交于基层的光线，通过公式θq＝sin-1(λ/2w0)来定义。
根据本发明一方面的另一变化，所述基层是盘片，并且所述盘片的反射表面包括多个槽和多个脊。所述脊高度为h。所述正交角根据正交于基层的光线，通过公式θq＝sin-1[(λ/2-4h)/w0)]来定义。
根据本发明的另一方面，提供一种相位差正交干涉测量分步探测方法，用于测定样品中有无靶分析物的存在。所述方法包括通过使用分式光电检测器配置来测量由探测激光束入射到盘片上产生的反射光信号的远场衍射图样的时间依赖强度，所述盘片具有识别分子的空间图样。所述方法进一步包括将来自所产生的光信号的第一正交和第二反向正交的分量相加。分量相加之前先将所述第一正交的分量进行反转。
根据本发明一方面的变化，所述强度通过从所述盘片的反射表面反射所产生的光信号来测量。
根据本发明一方面的另一变化，所述分式光电检测器配置是开环光电检测器。
根据本发明一方面的另一变化，所述分式光电检测器配置是象限光电检测器。
根据本发明一方面的另一变化，所述分式光电检测器配置包括第一和第二光电检测器。所述入射到盘片上的探测光束波长为λ，腰斑半径为w0。所述第一和第二光电检测器主要测量在基本一对正交角θq处的强度。所述正交角根据正交于盘片的光线，通过公式θq＝sin-1(λ/2w0)定义。
根据本发明一方面的另一变化，通过旋转所述盘片测量时间依赖强度。
根据本发明一方面的另一变化，所述盘片以80Hz旋转。
根据本发明的另一方面，提供一种相位差正交干涉测量分步检测方法，用于测定样品中是否存在靶分析物。所述方法包括对基本仅第一正交的反射光信号的第一部分的第一正交干涉角处的时间依赖差异进行测量。所述反射光信号由对激光束进行追踪而产生，所述激光束穿越平面阵列上的特定抗体和非特定抗体的交互区域。
根据本发明一方面的变化，所述方法进一步包括对基本第二正交的反射光信号的第二部分的基本第二正交干涉角上的时间依赖差异进行测量，所述反射光信号由对激光束进行追踪而产生，所述激光束穿越平面阵列上的交替区域。
根据本发明一方面的另一变化，所述方法进一步包括将所述反射光信号的第一部分的第一输出进行反转，所述方法还包括将反转后的第一输出与所述反射光信号的第二部分的第二输出相加。
根据本发明的另一方面，提供一种无比例无标记正交干涉测量分步检测方法，用于测定样品中是否存在靶分析物。所述方法包括使用入射腰斑半径为w0、波长为λ的聚焦激光束扫描盘片。所述盘片具有特定于所述靶分析物的受体分子的空间图样层。所述层具有充分尖锐的层边缘。所述方法进一步包括使用分式光电检测器配置来探测由扫描所述基本锐利的层边缘引起的远场衍射图样中的强度变化。所述分式光电检测器配置提供在一对正交干涉角的至少一个角度上的远场衍射图样的输出，所述正交角根据正交于基层的光线定义。
根据本发明的另一方面，提供一种正交干涉测量方法，用于测定样品中是否存在靶分析物。所述方法包括对排列在光学组件中的第一光电检测器的输出进行测量以接收反射光信号的基本仅第一正交。所述基本仅第一正交通过在基本第一正交角观测所述反射光信号而产生。所述反射光信号通过波长为λ、腰斑半径为w0的探测激光束入射到平面阵列上而产生。所述平面阵列具有至少一个脊，所述脊由特定于所述靶分析物的受体分子层而定义。所述正交角θq根据正交于所述平面阵列的光线，根据公式θq＝sin-1(λ/2w0)定义。
根据本发明一方面的另一变化，所述方法进一步包括测量排列在光学组件中的第二光电检测器的输出以接收基本仅第二反向正交。所述基本仅第二反向正交通过在基本第二正交角处观测所述反射光信号而产生。
根据本发明一方面的另一变化，所述第一和第二光电检测器在傅立叶平面中对反射光信号的远场衍射图样进行测量。
根据本发明一方面的另一变化，所述方法进一步包括反转所述第一光电检测器的输出，并且将所述第一光电检测器的反转后的输出与所述第二光电检测器的输出相加。
根据本发明一方面的另一变化，所述光学组件包括物镜。
根据本发明的另一方面，提供一种用于对生物样品中有无靶分析物进行干涉检测的设备。所述设备包括用于聚焦激光束的光源，所述激光束波长为λ、腰斑半径为w0。所述光源被排列以直接或者间接地使激光束入射到基层上。所述基层具有带空间图样生物层的反射表面。所述生物膜层包括多个受体分子覆盖层，每个覆盖层配置为绑定特定的靶分析物。所述设备进一步包括分式光电检测器，用于测量远场衍射图样的强度。将所述分式光电检测器定位以对与一对正交角中的至少一个角度基本相等的基本仅在观测角度上的强度进行检测。所述正交角根据正交于所述基层的光线，通过公式θq＝sin-1(λ/2w0)定义。
根据本发明一方面的变化，所述分式光电检测器包括用于阻挡所述远场衍射图样的除在所述正交角处外的部分的孔径。
根据本发明一方面的另一变化，所述反射表面包括用作激光镜的10层Ti2O5/SiO2电介质堆叠。
根据本发明一方面的另一变化，所述分式光电检测器是象限检测器，并且所述反射表面包括四分之一波长电介质堆叠。
根据本发明一方面的另一变化，提供一种用于检测平面阵列上是否存在靶分子的相位差正交干涉测量的设备。该设备包括用于产生探测光束的激光光源。所述设备还包括用于容纳所述平面阵列的平台。该设备进一步包括用于在所述平台处以基本表面正交方式引导所述探测光束的第一光学组件。该装置还包括具有第一侧面和第二侧面以及焦距的物镜。所述物镜在该物镜的第一侧面从所述平台偏移了近似等于所述焦距的第一距离。该装置进一步包括分式光电检测器装置，该装置用于测量由所述探测光束的反射产生的信号中的第一正交和第二正交。
根据本发明一方面的变化，所述平面阵列为盘片。所述设备进一步包括连接于所述平台的用于旋转所述盘片的旋转器。
根据本发明一方面的另一变化，用于测量的分式光电检测器装置为象限光电检测器，对所述象限光电检测器进行定位以产生对于信号中的第一正交的第一输出和对于信号中的第二正交的第二输出。
根据本发明一方面的另一变化，该设备进一步包括连接于所述第一输出与所述第二输出之一的反转电路以及连接于所述反转电路和所述第一输出与第二输出之另一的加法电路。
根据本发明一方面的另一变化，用于测量的分式光电检测器装置为第一光电检测器和第二光电检测器，放置所述第一光电检测器以产生对于所述信号中的第一正交的第一输出，放置所述第二光电检测器以产生对于所述信号中的第二正交的第二输出。
根据本发明一方面的另一变化，用于测量的分式光电检测器装置为开环光电检测器，对所述开环光电检测器进行定位以产生对于所述信号中的第一正交的第一输出和对于所述信号中的第二正交的第二输出。
根据本发明一方面的另一变化，用于测量的装置从所述物镜的第二侧面偏移了近似等于所述焦距的第二距离。
根据本发明的另一方面，提供一种用于检测样品中是否存在靶分析物的相位差正交干涉测量的系统，所述样品暴露在具有反射表面的盘片上，所述反射表面包括识别分子的多个空间图样覆盖层，至少一个识别分子特定于所述靶分析物。该装置包括用于容纳所述盘片的平台和用于旋转所述盘片的旋转器。该装置还包括用于波长为λ的聚焦激光束的光源。所述光源被排列从而直接或者间接的将所述激光束以腰斑半径w0入射到所述盘片上。该装置还包括用于追踪激光束越过所述识别分子的多个空间图样覆盖层的装置。该装置还包括分式光电检测器装置，所述装置用于测量在基本远场衍射图样的一对正交干涉角θq处的强度，所述远场衍射图样由追踪激光束越过所述平面阵列而产生。所述正交干涉角θq通过公式θq＝sin-1(λ/2w0)定义。
根据本发明一方面的另一变化，所述系统进一步包括物镜，该物镜被定位在所述平台上的盘片和用于测量强度的分式光电检测器装置之间。
根据本发明一方面的另一变化，所述用于测量强度的分式光电检测器装置具有与在一对正交干涉角θq中的一个的强度对应的第一输出以及与在所述一对正交干涉角度θq中的另一个的强度对应的第二输出。
根据本发明一方面的另一变化，所述系统进一步包括连接于第一输出和第二输出之一的反转电路以及连接于该反转电路和第一输出和第二输出之另一个的加法电路。
根据本发明一方面的另一变化，用于测量的分式光电检测器设备是象限光电检测器。
图1显示了与正交条件有关的本发明的一个方面，该正交条件在具有脊和槽的基层的步阶的一面上的入射光线和在该步阶的另一面上的入射光线之间； 图2显示了与图1类似的实施方式，其中所述“脊”的高度与生物膜层的厚度一样的小； 图3A显示了测定在衍射远场中建立正交的步阶检测； 图3B是聚焦在蛋白步阶上的激光束以及入射激光束腰斑的强度分布的示意图；在两个正交角上，由蛋白层引起的相位移动(+π/2或者-π/2)建立了衍射远场光强度的正交； 图4显示了本发明一个方面，其中衍射蛋白步阶在远场中具有双重正交； 图5A和5B显示了利用分式光电检测器配置中的微小变化而对被印记的蛋白进行步阶检测的光学设计的实施方式。
图6A和6B显示了本发明一个或多个实施方式的步阶检测的无比例性质。
图7A和7B显示了非特定约束的直接减少及其引起的时间追踪。
图8显示了在校准盘片上轮辐状图样的刀锋检测的化验性演示结果。
图9显示了单个轮辐式探测。
图10显示了与光束尺寸有关的分别用于分式探测器(点线)情况下和用于π/2掩膜(实线)情况下的极稀疏的轮辐或者点的探测。
图11显示了蛋白轮辐与计算机模拟的8nm蛋白轮辐的规则时间追踪的比较。
图12显示了蛋白信号的规则功率谱。
图13显示了培养后盘片的不同片段的蛋白高度变化的分布。
图14显示了二元化验的接收器运行特性。
图15显示了培养后不同蛋白点滴中的蛋白高度变化的分布。
图16显示了生物光盘(BioCD)上被印记的抗生物素蛋白脊的空间拓扑。
图17显示了图16中的盘片的空间频率解调图像。
图18显示了不拆离盘片条件下获得的生物光盘上的抗生物素蛋白不同高度的柱状图。
具体实施例方式 背景技术部分描述以外的方法正在开发或已经开发。部分其它方法利用生物的、光学的小型盘片(“生物光学光盘bio-optical CD)”或“生物光盘(bioCD)”)系统，所述系统包括用于扫描生物光盘的CD播放器，所述CD播放器允许使用干涉测量检测技术来感测生物样品中特定分析物的存在。正如下面的进一步讨论，这样的生物光盘设备优选为与在正交条件下基本工作的干涉测量检测系统一起使用。
复杂程度越来越高的蛋白组学[参见E.F.Petricoin、K.C.Zoon、E.C.Kohn、J.C.Barrett和L.A.Liotta发表在Nature Reviews Drug Discovery 2002年卷1第683-695页上的“Clinical proteomicsTranslating benchside promise into bedsidereality”]和蛋白相互作用网络[参见P.Bork、L.J.Jensen、C von Mering、A.K.Ramani、I.Lee和E.M.Marcotte发表在Current Opinion In StructuralBiology2004年卷14第292-299页上的“Protein interaction networks from yeastto human”；S.-H.Yook、Z.N.Oltvai和A.L.Barabasi发表在Proteomics2004年卷4第828-942页上的“Functional and topological characterization of proteininteraction networks”]产生了生物芯片的需求，所述生物芯片可对多分析物分子识别进行快速测试。一个重要的例子是用于表达式研究的蛋白微排列[参见P.F.Predki发表在Current Opinion In Chemical Biology 2004年卷8第8-13页上的“Functional protein microarraysripe for discovery”；B.Schweitzer、P.Predki和M.Snyder发表在Proteomics 2003年卷3第2190-2199页上的“Microarrays to characterize protein interactions on a whole-proteome scale”]和用于诊断医学的抗体芯片[参见S.P.Lal、R.I.Christopherson和C.G.dosRemedios发表在Drug·Discovery Today 2002年卷7第S143-S149页上的“Antibody arraysand embryonic but rapidly growing technology，”；Y.P.Ding、L.Y.Chen、W.Zhang、H.J.Cao、S.M.Ni、M.F.Zhou、H.Liang、Z.G.Ling、Y.Y.Geng和S.Q.Wang发表在Progress in Biochemistry and Biophysics2002年卷29第640-644页上的“Studies on simultaneously detecting multiple antibodies in theserum using microarray”；W.Kusnezow和J.D.Hoheisel发表在Biotechniques2002年卷33第S 14-S23页上的“Antibody MicroarraysPromises andProblems”]。干涉测量法的优势是具有比传统的荧光检测更高的光子通量并且从而得到更短的检测时间及/或增加的信噪比。
一个或多个本申请的发明人引入了生物学小型光盘作为灵敏旋转盘片干涉仪，该干涉仪在高速下工作并且为自参考模式[参见M.M.Varma、H.D.Inerowicz、F.E.Regnier和D.D.Nolte发表在Biosensors & Bioelectronics2004年卷19第1371-1376页上的“High-speed label-free detection byspinning-disk micro-interferometry”]。自参考优选地在机械旋转盘片上提供稳定的干涉测量。为了对光学路径长度灵敏，在信号和参考光束之间的相对相位被锁定为基本正交(π/2相位差)，优选为独立的机械振动或运动。一个或多个本申请的发明人在先定义了生物光盘的两种正交干涉测量检测类别。微衍射类(“MD类”[参见M.M.Varma、D.D.Nolte、H.D.Inerowicz和F.E.Regnire发表在Optics Letters 2004年卷29第950-952页上的“Spinning-diskself-referencing interferometry of antigen-antibody recognition”。还参见于2003年12月3日提交的名为“Adaptive Interferometric Multi-Analyte High-SpeedBiosensor”的美国专利申请No.10/726,772，其全部内容结合于此作为参考]。
使用制造在盘片上以将聚焦激光束衍射至远场的微结构，MD类的生物光盘被锁定为具有固定相对相位的正交。在一种实施方式中，具有λ/8的高度的金轮辐，优选为1024盘片，通过蒸发被沉积到一反射表面上，并且生物分子被固定在金轮辐或者槽上。因为相位差通过局部微结构的高度差而设定，所以它不受机械运动或振动的影响。固定不变的生物分子改变在远场中转变为振幅调制的相对相位。
通过使用自适应非线性光学混频，AO类锁定为正交，优选为在光折变量子阱中(photorefractive quantum well)[参见D.D.Nolte发表在J.Appl.Phys1999年卷85第6259页的“Semi-insulating semiconductor heterostructuresOptoelectronic properties and applications”；D.D.Nolte和M.R.Melloch发表在Photorefractive Effects and Materials的“Photorefractive Quantum Wells andThin Films”；D.D.Nolte和Ed.Dordrecht于1995年发表的Kluwer AcademicPublishers]，其适应地追踪信号和参考之间的相位[参见D.D.Nolte、T.Cubel、L.J.Pyrak-Nolte和M.R.Melloch发表在J.Opt.Soc.Am.B 2001年卷18第195-205页的“Adaptive Beam Combining and Interferometry usingPhotorefractive Quantum Wells”]。在一个实施方式中，被组成图案的蛋白结构调制探测光束的光学相位，所述探测光束被传送到光折变量子阱(PRQW)设备并且通过二波混频与参考局部振荡器光束混合。所述二波混频以高于1kHz的补偿频率对机械扰动进行自补偿从而保持正交条件。由旋转盘片上的蛋白结构产生的相位调制的频率高于所述补偿频率并且由光电检测器进行读取。
所述生物光盘正交类型在近场和远场之间的复杂性是折衷的。MD类型的生物光盘在盘片上需要更复杂的微结构，同时AO类型的盘片需要全息胶片以用于非线性光学混频。本发明引入一种与相位差成像类似的新的正交类型。由此，本发明的各个实施方式将会经常在此作为相位差类型(“PC类型”)提及。
在描述PC类型的各个实施方式之前，首先进一步解释本发明的干涉测量监测系统中正交所意指的含义。在某些特定的应用中，正交可以被狭义的解释为在干涉测量系统中当普通光学“模式”被分为至少两个彼此相位相差N*π/2(N为奇数)的“散射”模式时出现的现象。然而，如本发明(并且先前提及的Nolte等人发表的专利和/或未决的专利申请)中所使用，当至少一个模式与靶分子“相互作用”并且至少一个其它模式不与靶分子“相互作用”时，干涉测量系统处于正交，其中这些模式的相位差约为N*π/2(N为奇数)。有些干涉测量系统中“其它模式”与不同的分子相互作用，对正交的这种定义也可适用于这样的干涉系统。如果所述相位差为π/2(或者N*π/2，其中N为奇数)加上或减去约20％，则可以认为干涉测量系统基本上处于正交情况。
另外，在描述PC类型的各个实施方式之前，对本发明的干涉测量检测中的“边缘”或者“边缘检测”所意指的含义进行进一步解释。以下一个或者多个实施方式的不同描述部分可能提及对光进行衍射的边缘。本领域的普通技术人员可以理解，在此公开的所有实施方式中对步阶或者对光进行衍射的边缘的描述实际上提到了光衍射结合于整个光学波阵面上。严格的说并不只是边缘对光进行衍射。结合于光束的间断性或者步阶衍射到远场并得到检测。不同高度的步阶的间断性设置了光波向左或者向右的不同条件。整体差异作为衍射检测得到，而不只是步阶或者边缘。而且，关于本发明中的术语“边缘”或者“边缘检测”是指一般包括在此公开的差异检测技术。也就是说，正交干涉测量对表面高度的斜率或者导数进行检测。所述信号与dh(x)/dx形成正比。当该术语的更常规的用法可以表示只有在间断的步阶为某种“边缘检测”过程的特殊情况下时，在此用到的术语是指被更广泛地定义为如在此段落中所解释的在步阶中还包括“斜率检测”。
本发明通常涉及对旋转盘片免疫测定(生物光盘)的改良制造和读取。在一个实施方式中，优选地对所述盘片建立相位差正交干涉测量条件。优选地，该系统具有高达100％的光检测效率。该系统还优选地具有对激光强度漂移的自动补偿。
本发明的不同实施方式通常涉及用于将在材料中的空间光学相位变化转变为时间依赖强度的方法，该方法使用信号和参考波之间的正交条件，其中所述正交条件通过来自指数变化的衍射得到建立。所述光学相位变化可以是基层材料的折射率固有的变化，或者对于固定的蛋白或核酸而言由附加到所述基层的材料而产生。为可检测相位调制，可以使用包括相位掩膜板、振幅掩膜板、或者相位和振幅掩膜板两者的傅立叶滤波。所述掩膜板可以位于傅立叶平面的中心或者倾斜方向。所述信号的全部或部分通过光电检测器进行检测，或者通过检测器孔径进行检测，或者通过综合来自对应正交的贡献的分束检测器配置进行检测。时间依赖由于探测激光点相对所述材料的运动而产生，反之亦然。
正如以下将要讨论的，本发明的一个或者多个实施方式包括使用了一个或者多个透镜的光学组件。在使用透镜的光学系统中，定义了特定的平面。包括物体平面(其中存在物体)、透镜平面(其中透镜存在)、图像平面(其中图像存在)和检测器平面(其中光得到检测)。由于多个透镜，则可能存在多个图像平面。在特定光学系统中，当物体平面与透镜平面的距离为一个焦距时，傅立叶平面被定义在与所述物体平面相对的透镜相距一个焦距的位置。孔径和掩膜板可以位于傅立叶平面或者图像平面或者透镜平面(直接位于透镜之前或之后)或者检测器平面。所述孔径或者掩膜板可以控制传输的光量(振幅掩膜板)或者光的相位(相位掩膜板)。位于不同平面的掩膜板的作用是在检测器处产生最强的相长干涉和由此产生信号。对可能的掩膜板图样和位置进行选择可以控制通过单个检测器或者检测器阵列而检测到的强度，本发明的范围考虑了所述选择中参数组的各种广泛的变化。通过适当选择掩膜和位置来对信号进行优化和最大化。
应当理解在两个正交角上的反射光信号的至少一个和可能两个(相反的)正交条件下的分式检测器配置的广泛变化和用于测量反射光信号(包括但不仅限于远场衍射图样)的强度的其它装置。所有这种分式检测器配置或者用于测量的装置都被考虑在本发明的范围之内。在一个实施方式中，所述分式检测器配置可以是开环光电检测器。如将在以下讨论的那样，在一个实施方式中将分式光电检测器与反转和加法电路一起使用。另外，可以使用两个分离的光电检测器，对每一个进行定位以接受相应正交信号。在此描述的这些和其它变形中，应当理解用于测量强度的装置可以是较大的光学组件的一部分，所述较大的光学组件可能包括孔径、各种相位和/或振幅掩膜板，以及本领域普通技术人员公知的其它元件。另一种可能的变形使用单个的检测器，在所述检测器中信号碰到孔径和/或刀锋，所述孔径和/或刀锋屏蔽了光电检测器的至少一部分，从而所述光电检测器接收基本包含单一正交的信号。所述分式检测器配置还可以是象限光电检测器。本领域普通技术人员公知的其它变形也被考虑在本发明的范围之内。例如，应注意的是分束检测器或者象限检测器恰好是可变得非常大的、具有许多检测元件的检测器阵列的特殊情况。
在本发明的至少某些实施方式中，通过具有差分电输出的分式光电检测器来取代光学系统中相位掩膜板的角色。可以认为对这些实施方式的执行在近场和远场两者中至少具有部分的优越性。在近场中(与MD类型进行比较)优选地不需要盘片的微结构。在远场中(与AO类型进行比较)优选地可以使用更简单的检测。优选地，这样的途径仍然是自我参考的(至少提供了抵制机械运动的某些稳定性)。并且，通过步阶衍射将本发明的不同实施方式锁定为正交，例如，盘片上的空间变化固定不变的蛋白图样。
参考图1-4，解释了本发明的一个或多个实施方式的与步阶衍射正交有关的某些方面。图1显示了本发明的至少某些使用了步阶衍射和正交角的实施方式的一个方面。
参考图1，在本发明的一个实施方式中，基层200优选为具有多个槽215和脊225，并且在槽215和脊225之间的交界面上具有边缘205。光线210入射到槽215上，光线220入射到脊225上。脊225的高度h(图1中的参考数字230)由脊225定义，所述高度h包括底部表面226和顶部表面228之间的厚度以及受体分子250的层所附加的厚度。高度差δh通过绑定于受体分子250的靶分子260(靶分析物/分子的实例包括但是不仅限于蛋白)的附加厚度产生。应该理解其它这样的实施方式也被考虑在本发明的范围之内，例如受体分子250未被直接绑定于反射基层200的槽215或者脊225而被绑定于某些中间层的实施方式。
如图1所示，边缘205对光线进行衍射并且在入射到步阶的一侧的光线210和入射到该步阶的另一侧的光线220之间建立正交条件。例如，对于具有固定高度230(在以下的方程式中作为高度h提及)的蛋白或者其它的靶分析物，正交角θq在以下方程中给出 0.5*w0*sinθq+2h＝λ/4 对于波长为λ并且光束宽度为w0的入射光束。则， θq＝arcsin[(λ/2-4h)/W0] 在正交角θq处，来自脊的反射光222和来自槽的反射光212具有为π/2的相对相位差，或者正交。在远场中，所述正交角θq处的强度等于一半。在所述正交角θq处的强度会由于脊225上的靶分子260(包括但不局限于蛋白或者其它生物分子)的存在而线性敏感。本领域技术人员应当理解，可替换的等同描述是，光学相位中的间断变化导致了反射光束在所述检测器上发生侧面位移或者角度偏转。
参考图2，应该理解所述“脊”可以具有高度h(图2中的参考数字330)，该高度由受体层350自身(在其它语句中高度h和生物层或者受体分子350的厚度一样的小)设定。在本发明的这一实施方式中，基层300优选为具有多个槽315和脊325，并且在槽315和脊325之间的交界面上具有边缘305。光线310入射到槽315上，光线320入射到脊325上。脊325的高度h(图1中的参考数字330)由受体分子350的层的厚度来定义。高度差δh通过优选地绑定于受体分子350的靶分子360(靶分析物/分子包括但是不仅限于蛋白)的附加厚度产生。
如图2所示，边缘305对光线进行衍射并且在入射到步阶的一侧的光线310和入射到该步阶的另一侧的光线320之间建立正交条件。例如，对于具有固定高度330(在以下的方程式中作为高度h提及)的蛋白或者其它的靶分析物，正交角θq在以下方程中给出 0.5*w0*sinθq＝λ/4 对于波长为λ并且光束宽度为w0的入射光束。则， θq＝arcsin[(λ/(2*w0)] 此外，如图2所示，在正交角θq处的生物分子会具有线性敏感。
如果蛋白印记为轮辐图样或矩形阵列元素，则当已印记的蛋白扫过有限宽度激光点时，在精测定义的角度处发生正交，该角度仅取决于所述激光点的尺寸并且基本上独立于蛋白受体层的厚度。参考图3A和3B，存在所显示的步阶(或者斜率)检测相位差检测，该相位差检测在衍射的远场中建立了正交。在通常的术语中，当有限尺寸的光束照射所述步阶时，从蛋白和裸基层(或者另外的蛋白)衍射的部分光波将在正交角处是相位正交的，其中当部分光波之间存在π/2相位差时，所述正交角被设为θq。
图3A显示有限光束440照射反射基层400上的印记蛋白450(一种优选的印记蛋白的图样)的边缘405，所述有限光束440的强度为I0，波长为λ，宽度为w0。所述基层400(优选为一旋转盘片)的运动由箭头475表示。反射光线412和422分别从所述光束的每一半的中点出发。在特定的角度正交角θq处，所述光线具有相对的π/2相移。所述正交角θq为 θq＝arcsin[λ/(2*w0)] 参考图3B，可以理解存在这样两个角度在这两个角度处反射光线处于正交条件。也就是说，存在两个角度，一个对应+θq，一个对应-θq。图3B显示了有限光束540照射反射基层500上的印记蛋白550(印记蛋白图样的优选部分)的边缘505，所述有限光束540的强度为I0，波长为λ，宽度为W0。图3B的底部部分显示了光束腰斑宽度W0强度的(高斯)下降。所述基层500(优选为旋转盘片)的运动由箭头575表示。反射光线512和522分别被从所述光束的每一半的中点追踪并追踪为+θq的正交角，其中所述光线具有π/2相对相移和正交干涉。反射光线513和523分别被从所述光束的每一半的中点追踪并追踪为-θq的正交角，其中所述光线具有-π/2相对相移和正交干涉。
参考图4，可以理解相同的元件以先前使用的同样的参考数字进行标度。远场中强度的变化表示在图4的上半部分，该部分显示了光束的一半的增大和光束另一半的减小。正如在前提及的，衍射蛋白步阶在远场中具有双重正交。一重引起强度的正变化，另一重引起强度的负变化。在检测期间，优选地对一重或者另一重进行检测。可替换的，对两重都进行检测，但是在同时将两重相加之前将一重的相位进行倒转。这样，如果对整个场域进行检测，在不将一个正交信号倒置时，所述两个正交被抵消。然而，如果远场的一半通过例如刀锋而被采集，则一半的可能信号被抽取。而且，如果分式检测器配置和逆变器以及加法电路一起使用，则如下面参照图5A和5B所讨论的那样，可以获得全部信号。
参考图5A和5B，其显示了用于印记蛋白或者其它靶分子的步阶或者斜率检测的光学设计的两个实施方式。应当理解相同的元件以同样的参考数字进行标度。基层600优选为以旋转轴610旋转的旋转盘片。光学组件的光轴650可以放射状的从基层600的旋转轴610向内或者向外移动以使其暴露给例如某些特定的靶区域。优选的将焦距为f的物镜620用于所述光学设计中，并且将其插入基层600和光电检测器630(图5A)或者730(图5B)之间。在示例实施方式中，物镜620与盘片600分离放置，分离放置的距离f与物镜的焦距相等，并且物镜620也与光电检测器630(图5A)或者730(图5B)相距距离f。在图5A和5B的实施方式中，光电检测器630、730优选为分式光电检测器，分别通过635、735分开表示。应当理解本发明的范围考虑了分式光电检测器配置的不同的其它实施方式。所述光电检测器可以为例如象限检测器或者开环光电检测器。类似的，如先前所讨论，在本发明的某些实施方式中，仅有远场的一半通过刀锋或者其它类似的机构而被采集，并且仅可能信号的一半被抽取(所述的一半基本上仅为一个正交)。
正如图5A和5B所示，光电检测器630、730被定位于具有中心线与轮辐的长轴平行的傅立叶平面处，以采集分式光电检测器的两个一半之间的差分信号。在示例实施方式中，来自于分式光电检测器630、730(基本上对应于一个正交)的一部分的信号在与来自光电检测器(对应于另一个正交)的另一部分的信号通过加法电路660相加以产生输出信号680之前，优选地经由反转电路640发送。输出信号680是远场强度度量，并且当探测激光束扫描过基层600时(例如，当基层被旋转时)，输出信号680变化。可替换的，正如先前提及的，可以只采集一半的信号，优选地基本上只对应于一个正交(虽然两个正交的相对少量的重叠在对信噪比不产生较大有害影响时是可以容忍的)。
参考图6A和6B，其显示了本发明的至少某些实施方式的步阶或者斜率检测的无标记特性。边缘没有固定的长度标度。因此在傅立叶平面中，边缘孔径也没有长度标度。这样的好处是不需要将滤波器的尺寸与光束的尺寸(其可能不同)相匹配。正如在图6A和6B所示，减小的激光点尺寸(810a，820a，830a)仅仅造成在分式光电检测器配置850上更大的点尺寸(810b，820b，830b)，所述分式光电检测器配置850优选地被定位于傅立叶平面上。也就是说，改变激光点的尺寸时不需要改变分式光电检测器的配置。这样，只要轮辐的宽度大于光束的直径，则该系统与点的尺寸或者轮辐的宽度的标度无关。
参考图7A和7B，其显示了潜在的可应用于本发明的一个或者多个实施方式的其它方面。如图7A所示，优选地执行无载波的边带检测。激光束1050沿由箭头1075指示的方向在特定抗体1000和非特定抗体1010的交互轮辐上进行追踪。在轮辐1000、1010的边缘处的峰高只涉及特定绑定和非特定绑定之间的差别。这样，没有减少非特定绑定的“单独的”测量。参考图7B，其显示了非特定绑定的直接减少和所产生的时间追踪。信号的高度只依赖于特定和非特定绑定之间的不同。不存在载波频率，并且所有的检测强度变化都在包络中。进一步的细节参见于2005年2月1日提交的名为“Method forConducting Carrier-Wave Side-Band Optical Assay for Molecular Recognition”的美国临时申请No.60/648,724，以及与本申请同一天提交的名为“Differentially Encoded B iological Analyzer Planar Array Apparatus andMethods”的美国申请No.？？？/？？？,？？？，本申请要求该临时申请的优先权。
参考图8，其显示了由校准盘片上的轮辐图样的刀锋检测的化验证明得出的数据。在根据本发明的一个示例中，具有在玻璃盘片中刻蚀12nm深度的校准盘片被用于证明化验性能。在图8中的顶部曲线中，对整个场域进行检测，并且在用于从第二最低曲线的一半功率处给出信号条件。对于本底噪声来自于零阶光束和玻璃中折射率变化引起的散射光之间的外差的传输化验，对零阶光束的抑制进一步降低了本底噪声。
参考图9，其显示了信号轮辐检测。特别的，显示了与光束940有关的极薄的轮辐或者点900的检测。应当理解，尺寸小于光束宽度的轮辐或者点仍然可以在远场中建立正交条件。在图9所示的实施方式中，可以对宽度a＜＜w的单个小轮辐或者点进行检测，其中w为光束940的宽度(优选地为如图所示的具有高斯分布的激光束)。可以使用与用于宽轮辐的相同的分式检测器配置来检测小脊。但是当π/2物体掩膜板与孔径检测器组合使用时，可能有略微更好的性能，如图10中所示。如先前所解释，选择不同的光学平面处的掩膜板可以将在检测器处的有效干涉最大化。当将盘片上的斜率和边缘转变为检测器处的强度调制时，π/2掩膜板非常有用。在特殊情况下，使用掩膜板时可以无需使用分式检测器，同时还可以允许检测远场中所有的强度。这种方法精简了检测器，但是需要在光学系统中附加掩膜板。
和/或与本发明一起使用的生物压缩盘片(生物CD)是一种灵敏的检测平台，用以例如检测旋转盘片表面上的被组成图样的固定生物分子。本发明的各个实施方式提供了对具有高重复性的达到亚纳米级的光路长度变化进行高速测量(10微秒每点)的旋转盘片干涉测量。如上所述，在机械旋转盘片上实现稳定的干涉测量的一个重要方面是锁定信号光束和参考光束的相位的自参考以达到独立于机械振动或者相对运动的正交(π/2相位差)。
应当理解，干涉测量的相位差类型(PC类型)可以通过本领域普通技术人员所公知的各种广泛的方式实施。在本发明的一个实施方式中，使用在盘片上以1024轮辐图样进行光刻法来固定蛋白(预期在本发明的范围之内，轮辐的数量可以与其它设计参数一起广泛地变化)。印记蛋白图样的步阶衍射聚焦激光束，所述激光束优选地在傅立叶平面上通过分式检测器配置被检测，所述分式检测器包括但不局限于分式光电检测器、两个分离的光电检测器、象限检测器并且更基本的为光电检测器阵列。来自分式检测器配置的信号可能是微分的，所述分式检测器配置在电子领域起到了与在光学相位差成像中的相位板类似的作用。
如以下将进一步讨论的，在高速无标记生物感测中，PC类型的潜力通过两个分析物的免疫测定得到证明，所述免疫测定显示了非特定绑定的良好排斥以及低抗体交叉反应。执行抗IgG免疫球蛋白的免疫测定，检测低于一皮克的绑定分析物。为显示缩放比例达每个盘片成百或成千的分析物的潜力，还对小滴的蛋白溶液进行化验。
容纳被组成空间图样的生物层的反射表面将已聚焦的激光束衍射成不均匀的远场强度，如图4中所示。图4显示了入射到基层500上的腰斑宽度为W0的已聚焦的高斯光束540。如以上在前的推导，正交条件存在于通过生物层530的光束和入射到裸平面的光束之间，此时在以下给定的角度处观测 θQ＝sin-1(λ/2w0) (1) 在远场衍射图样中强度的最大变化由锐利的生物层边缘引起，并且在该正交角处被观测到。在符号相反的衍射角处存在两个符号相反的正交干涉角。当采集全部强度时，两个信号抵消。为了获得蛋白信号，优选地在傅立叶平面上使用具有反转和加法电路的分式检测器(示例在图5A和图5B中显示，应当理解可以在本发明的范围之内预期其它的分式检测器配置例如象限光电检测器)。在锐边的情况下，信号与由蛋白层引起的相移成线性比例，并且与蛋白的高度成线性。
由被组成图样的生物层引起的远场中的变化由下式给出 其中K(θ)为菲涅耳因子，θ为检测角，Einc(x)是入射光束的区域，并且p(x，t)＝eiφ(x-vt)为用于蛋白的相位方程，所述蛋白具有相位，所述相位用于具有折射率n、以速度v变化的蛋白高度h(x)的生物层。在我们的化验中，函数h(x)近似的为具有高度为8nm和折射率为1.33的方波。方程2的平方模数给出了由具有差动通道的分式光电检测器检测到的远场强度。得到的电子蛋白信号近似的与光束轮廓的卷积和蛋白高度分布的一阶导数dh(x)/dx成比例。因此这一技术为斜率检测技术。蛋白图样的边缘越锐利，产生的信号越强。
为了更好地介绍化验，下面讨论在获得化验数据时使用的装置和方法的细节。应当理解这些细节仅为示例，并且本发明的范围考虑了这些细节的广泛变形。相位差生物CD优选地由直径为100mm厚度为1mm的硼硅酸盐玻璃盘片制成。所述盘片优选地被用作中心波长在633nm的激光的反射镜的10层Ti2O5/SiO2电介质层所覆盖。可以使用以下物理吸附的方式将蛋白固定到盘片表面上通过1)硅表面的硅烷化，2)用于高亲和力固定的生物素-抗生物素蛋白的共价绑定，或者3)对ATPES环氧化物表面覆盖的共价绑定。
所述生物光盘片的反射表面优选的为电介质，所述电解质具有多个层以增强光反射并且将表面处的电场的大小的最大化。四分之一波长多层膜为用于达到这些条件的最常用的电解质结构，但是也可以使用例如硅的氧化物层。
对硅表面进行氯化十八烷基硅烷(chlorooctadecylsilane)处理的标准方案可以获得硅烷化。蛋白通过与有机端基的疏水相互作用绑定。蛋白的图样制作优选的通过凝胶压印方法而完成。
在高亲和力生物素-抗生物素蛋白过程中，所述表面被与生物素结合的聚琥珀酰亚胺聚合体所覆盖。然后应用光刻法，在所述光刻法中刻胶被旋转涂布在聚烯琥珀酰亚胺聚合体涂层的顶部上光并且通过例如1024轮辐光掩模板而被曝光和显影。然后将盘片的表面暴露给暴露区域中被附加于生物素的抗生物素蛋白。然后将生物素(酰)化的抗体添加并附加于绑定在暴露区域中的抗生物素蛋白上。
ATPES环氧化物涂层由标准方案获得。应用光刻法并且使用1％硼氢化钠溶液处理所述盘片，所述1％硼氢化钠溶液对曝光后的盘片表面进行蚀刻。在取出光刻胶后，盘片具有有图样的表面，该表面共价绑定蛋白。物理吸附和对表面的共价绑定都产生在轮辐图样中具有清楚锐边的蛋白图样，当盘片旋转时，所述轮辐图样通过所述探测激光点扫描。
在一个实施方式中，光学检测系统优选地使用5cm焦距的物镜以将635nm波长的二极管激光束在盘片上聚焦到大约20微米的直径。被反射和散射的光通过光束分束器被分开并且被引导至在物镜的傅立叶平面处的象限光电检测器。所述象限检测器优选地具有三个输出通道总的强度、上半部分和下半部分的差分、以及左边和右边的差分。根据蛋白轮辐的定位，一个差分通道给出预期的相位信号。另一个差分通道提供用于调整和盘片晃动的诊断，同时总的通道提供与来自于盘片的瑞利散射损耗和其它散射损耗有关的振幅信息，所述损耗对于相同的蛋白印记而言很小或者可以忽略。
所述盘片优选地以80Hz的固定频率在稳定的旋转器上(Lincoln Laser公司)旋转，当蛋白轮辐通过聚焦的激光点时产生时间依赖相位和振幅信号。图11显示了光刻法印记FITC-结合抗生物素蛋白(Sigma)和生物素结合抗兔IgG(sigma)双蛋白层的测量时间追踪，并且所述测量时间追踪与假定蛋白轮辐的高度为8nm、宽度为100微米情况下的计算机模拟进行比较。图12显示了检测到的3kHz带宽的信号的电功率谱。由分布在电介质堆的多个交界面上的，由于表面粗糙引起的噪声，比检测器和激光系统的本底噪声高出15dB。来自于蛋白轮辐的蛋白信号的信噪比为25dB。
为了证明将PC类型生物光盘作为免疫测定实施的潜力，我们在两重化验中进行了特定的抗原-抗体绑定。荧光共轭牛血清白蛋白(FBSA)通过使用与电介质覆盖的玻璃盘片直接接触的、被组成图样的、由FBSA渗透的聚丙烯酰胺凝胶而被印记。对于这一实验化验，使用氯化十八烷基硅烷来对表面进行活化。在聚丙烯酰胺凝胶和表面之间的接触区域处，蛋白扩散出凝胶并且通过物理吸附而被固定。印记技术的质量通过荧光现象和原子力显微镜进行测试。所述BSA是相对惰性的，并且在所述盘片的表面上产生通用载体模板，然后所述盘片的表面可以使用活性或惰性蛋白或者其它控制分子进行回填(在BAS之间的轮辐区域中)。
然后用特定的抗原分子回填所述盘片。所述BSA印记盘片被分割成四个90度的象限。在四个象限的每一个中的未印记槽分别被四种不同的化学成分回填1)磷酸盐缓冲剂，2)兔IgG，3)FBSA以及4)马IgG。所有填充蛋白溶液的浓度为20μg/ml。然后准备好的盘片在抗特定的识别分子的带中被培育。三个环形的带在穿过所述四个象限时，实际上产生了总共12个虚“阱”以用作于许多对比化验中的特定化验中。内侧里边的带以抗马IgG进行培育，并且外侧的带以抗兔IgG进行培育，并且两者的浓度都为20μg/ml。中间的带相对于抗靶样品不进行培育抗靶样品，但是经历了和与所有的带经历相同的冲洗步骤，并由此给出化验的稳定性测量并且用作负控制。在12个阱中，4个是用来测量冲洗分类的对比阱，4个是是用来用于测量对BSA的抗体的非特定绑定的对比阱，2个用于测试抗体-抗原的交叉反应，2个用于测试特定抗体-抗原绑定。
化验结果显示在图13和14中。图13显示了不同部分向抗体曝光后的高度变化的分布。这两个特定化验的表现与其它的化验具有显著的差异，在负控制、对FBSA的抗体的非特定绑定以及应用抗马来抗兔和应用抗兔来抗马的交叉反应(CR)之间存在的差别不大。这显示了在化验中不存在显著的交叉反应或者非特定绑定。两个特定二次化验(绑定到兔的抗兔和绑定到马的抗马)具有60％和80％的反应。标准偏差分别为20％和30％。图14显示了该化验的接收器工作特性(ROC)曲线。非特定绑定部分被用作假阳性。该曲线显示了特定和非特定绑定之间的本质区别，在交叉反应和非特定绑定之间仅有很小的差别。从分布中计算出p值小于0.01。
为了测试光学检测过程的可变性，在进行本试验之前，通过在物理吸附表面上凝胶压印印记而印记了FBSA的盘片被拆卸下来，总共旋转了90度之后再重新安装，并且被再次扫描四次，并且所有重复的值在标准误差5％之内。如果盘片没有在旋转后再重新安装，则标准误差下降到小于2％。所以，对于将来的剂量反应测试，光学检测具有相当小的标准误差，是稳定的并且可再现的，优选地，在将固化和培育化学成分进行得更加均匀之后再进行光学检测。
为了证明每个盘片上的化验可以增大到成百或者成千个，在APTES环氧化物表面覆盖层上利用点蛋白溶液进行化验。在进行光刻法之后，将盘片在硼氢化钠的去离子水溶液中浸泡12小时。曝光后的表面通过所述溶液进行蚀刻并且变得非常的吸水以至于不容易吸引蛋白。在去除所述光刻胶后，盘片被覆盖的部分仍然具有牢固地绑定蛋白的APTES覆盖层。马IgG和鸡IgG的区域被定位于盘片上。这些区域的尺寸大约为10mm。然后，蛋白的区域采用同样尺寸的抗马IgG的定位进行培育。图13中显示了不同的点滴中的蛋白高度变化的分布。其中特定和非特地绑定之间的差别十分清楚可见，所述差别具有经过计算的小于0.01的p值。尽管在该化验中点滴的尺寸为10mm，但是通过喷墨打印机可以将其很容易地缩小至1mm或者甚至更小，因此可以在每个盘片上进行成千或者甚至更多的化验。
现在通过描述某些化验数据，对选择的实施方式的附加特性和潜在优势进行描述，所述实施方式可能包括或者不包括本发明的特性。应当理解的是本发明通常涉及自参考干涉测量光学生物传感器，所述传感器测量来自于旋转盘片上的蛋白的相位调制。以高速对所述图样所进行的光学检测产生的本底噪声远低于1/f噪声。盘片上的周期性蛋白图样提供了空间载波频率，该空间载波频率优选地被解调制为低变化蛋白包络，所述蛋白包络可以以高精度进行分辨。
在本发明的一个实施方式中，对一个盘片的两次连续差分扫描进行差分处理而不进行任何盘片拆卸，得到与在20微米的聚焦点直径中的5毫微微克蛋白对应的仅为20pm的均方根表面高度的测量误差。下面对预测免疫测定性能以作为阱尺寸函数的简单面积比例关系进行讨论。下面的讨论还证明了差分相位差生物光盘的表面质量灵敏度低至0.2pg/mm。所述生物光盘灵敏度与表面等离子体共振传感器的灵敏度可以相比，但是所述生物光盘片灵敏度优选地在没有共振结构的情况下达到，因此制造和操作起来相对容易。
如以上两个段落中介绍的，下面将对使用差分相位差检测的细节进行进一步的讨论，所述差分相位差检测与提供空间载波频率的空间图样蛋白相关联，所述空间载波频率在频率-解调制后形成缓慢变化的蛋白包络。以高速进行的图样的光学检测产生的本底噪声远低于1/f噪声。对盘片的两次连续的差分扫描进行差分处理，得到与在20微米的聚焦点直径中的5毫微微克蛋白对应的仅为20pm的均方根表面高度的测量误差。利用尺寸的近似缩放比例，优选地可以获得0.2pg/mm的表面灵敏度。
同样的，如先前所讨论的，光学扫描系统优选为差分相位差系统。所述系统优选地包括稳定的发电机(Lincoln激光)、635nm激光光源(连贯的)和具有输出信号的分式象限检测器，所述输出信号在与所述盘片表面的运动方向垂直的通道之间进行差分处理。得到的净信号因此与盘片表面高度的第一空间导数成比例，或者在盘片上具有被组成图样的蛋白的情况下，与蛋白表面质量密度的导数成比例，其中我们假定相位调制与表面密度成正比。
在本发明的一个实施方式中，所述的生物光盘的盘片为具有635nm中心波长的多层电介质镜。盘片的顶部SiO2表面通过在生物素(酰)化的聚琥珀酰亚胺聚合体覆盖层上的抗生物素蛋白被组成图样，所述生物素(酰)化的聚琥珀酰亚胺聚合体覆盖层通过硅烷被附加到所述硅表面上。所述的抗生物素蛋白包括具有空间周期性的一系列的脊，所述空间周期性作为盘片半径的函数成线性变化。典型的周期为大约150微米。盘片以5000rpm的速度转动，并且所述激光被聚焦为直径为20微米的点。检测频率典型的为50kHz，所述检测频率远离激光和电子放大器的1/f噪声。光学性能在散射噪声极限大小的一倍半的范围内。应当理解，广泛不同的工作参数也被考虑在本发明的范围中。以上提到的空间周期、盘片旋转速度、聚焦的激光点直径和检测频率仅是出于示例作用。
参考图16，其中显示了盘片的所选部分的蛋白轮辐的表面拓扑。眼睛所能见到的差分信号为具有阴影的3D拓扑。亮信号是来自于作为引导的蛋白步阶，同时暗的负信号来自于对应的拖拉步阶。空间载波频率被解调制以获得蛋白的包络函数，如图17所示。所述包络在激光探测光束的范围内缓慢变化。正如前面提到的，在本发明的不同实施方式中，优选地对两个连续扫描之间的差别进行测定。
图18中显示了两个连续扫描之间的差分数据的柱状图。在不进行解调制的情况下，高度分布的宽度为75pm。在进行解调制后所述分布仅为20pm。这是每个聚焦点面积上的平均高度测量误差，由系统的机械性能(扫描之间的重新定位误差)决定，并且不受激光稳定性或其基本限度的限制。所述表面高度的不测定性可以被转变为用于差分相位差生物光盘的表面质量灵敏度。
下面在求导中所进行的基本缩放假设是生物光盘表面高度分布的两次连续扫描的测量误差的非相关随机分布的假设。从上述的条件出发进行简要的讨论，但是这样的假设与生物光盘通常所遭遇的条件有关。背离非相关随机表面粗糙度的假设将导致不同的缩放比例以及由此产生的每个面积的质量不同值。例如，如果在差分表面测量中的误差是与空间相关的，那么Smm与下面得出的值(在当前系统中具有大约为10pg/mm2的有限值，虽然随着系统稳定性的提高这一数值将会更小)相比会增大。
根据图8，对应于每聚焦点5毫微微克蛋白，所述聚焦点直径为20微米，在两次重复的盘片扫描中之间的表面高度中的不测定性被测定为每聚焦点20pm。与该测量相关的表面质量灵敏度为0.004pg/(0.02mm)2＝10pg/mm2。但是为了与其它的表面质量检测技术例如表面等离子体共振进行比较，这一数字需要在非相关随机表面粗糙度的条件下进行正确的比例缩放以达到为1mm的对应尺寸，所述非相关随机表面粗糙度通过传感器面积的平方根减小了测量的标准误差。在1mm的尺度上，相等的缩放表面高度灵敏度为 其中wmeas为与测量的高度差Δhmeas相关的点直径。当Δhmeas＝20pm且w0＝20微米时，Δhmm＝0.4pm。有趣的是，请注意该平均表面高度灵敏度低于质子的半径。与该蛋白高度有关的质量为 Δmmm＝Δhmmρm1mm2 (4) 其中，当Δhmm＝0.4pm时，Δmmm＝0.2pg。
为了获得用于表面质量灵敏度的常规缩放比例，组合方程(3)和(4)以得到 由此测定灵敏度为 其为每长度的质量的单位。
对于在面积A上分布传感器的单个化验，能在化验中被检测到的最小的捕获质量为 作为示例，如果化验面积为1mm2，则检测到的质量为0.2pg。由此，我们推断出在每平方毫米上的恰当的比例表面积灵敏度为 该面积依赖灵敏度与通过SPR测定的最优值可以进行比较。该灵敏度不需要进行共振就可获得，并且因此强得多，并且比其它的干涉测量方法或者依赖于共振以提供高灵敏度的共振方法更容易进行制造。
方程(7)的平方根比例是信号在更大面积上进行平均的结果。这提供了在生物光盘上的具有强大优势的测量。通过干涉测量的灵敏度获得的每个聚焦点的灵敏度通过信号在为单个聚焦点面积的多倍的面积上进行平均而得到提高。例如，直径为20微米的点进入为1mm2的50倍的面积中。其平方根通过因数7或者近似的数量量级而改进。
所述PC类型生物光盘的性能通过引入有用的权衡而介于前面讨论的MD类型和AO类型的性能之间。其相位差信号比MD类型中的显著增强，并且在硅表面上的固定更加均匀。另一方面，所述PC类型检测盘片上的蛋白图样的导数h’(x)，而所述AO类型直接对蛋白剖面h(x)作出反应。所述AO类型方法因为其积极的适应性也更稳定，但是实施起来更加困难。作为一个示例，关于在美国公开申请No.2004/0166593A1中公开的AO类型，其公开的图中有光电检测器444A和444B。然而，在AO类型中，从不同的空间模式而来的两个光束截然不同而且彼此分离。所述两束光束也可以利用承载大部分振幅信息的“直接”光束和承载相位信息的“衍射”光束来承载极其不同的信息。这样，在美国公开申请No.2004/0166593A1中的图21中的光电检测器444A和444B组合了相位和振幅而不是分离他们。然而，在PC类型中，优选地，仅存在被散射的反对称的单个产生空间模式。当该散射光在本发明的分式光电检测器配置中被检测和进行差分时，只有相位信息被恢复。振幅信息通过简单探测所有的光而获得。
共同的，具有简单盘片制造和简单检测特点的PC类型的优点是提供了新的生物光盘正交类型的在进行多样性多分析物化验时的良好的应用前景。所述PC类型是在优选地不具有共振结构的旋转盘片的自由表面上的表面垂直自参考干涉测量的类型。干涉测量元件优选地具有和激光的聚焦点一样小的表面面积，具有的相互作用长度仅与生物层的厚度一样长，并且不依赖于使得结构难以制造的光学共振。
以上描述的检测系统是通过利用反射光束配置的生物光盘的检测系统来进行描述和图示。应当理解本发明的范围还考虑了本发明也包含被配置以用于与生物光盘一起使用的检测器，其中所述生物光盘片被配置以产生被传输的信号光束。
应当理解尽管已经对用于检测生物样品中的血蛋白的存在的生物光盘和相关检测器系统进行了描述，所述生物光盘和相关的检测系统可以被用于其它的应用中，例如包括水和其它液体样品的环境样品的分析。
已经结合优选实施方式对本发明进行了图示和详细描述，同时本发明的系统还可以具有各种变型和可替换的形式。然而应当理解，本发明不仅限于此处特定公开的内容，本领域技术人员仍能够在不背离如权利要求所示的本发明的范围和精神的情况下，进行多种修改、补充和代用。
权利要求
1.一种检测生物样品中有无靶分析物的无标记相位差正交干涉测量方法，所述方法包括
将基层的反射表面暴露给所述生物样品，所述反射表面具有受体分子覆盖层的空间图样，每一覆盖层特定于特定的靶分析物；
使用分式光电检测器测量反射信号的远场衍射图样的强度，所述反射信号由聚焦探测激光束所产生，所述聚焦探测激光束的波长为λ，在扫描至少一部分所述基层时以腰斑半径w0入射到受体分子覆盖层的空间图样上；
其中通过采用分式光电检测器测量两个观察角度的至少一个的强度来测量在基本正交条件下所述反射信号的一部分的强度，所述两个观察角度与一对正交角基本相等，所述正交角θq由正交于所述基层的光线通过以下公式来定义
θq＝sin-1(λ/2w0)。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括将在所述一对正交角中的一个处的分式光电检测器的输出进行反转，并将反转后的输出与在所述一对正交角中的另一个处的分式光电检测器的输出相加。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括在使用所述分式光电检测器测量强度之前先将所述反射信号通过一物镜。
4.根据权利要求3所述的方法，其中对所述反射光束的远场衍射图样的强度测量是在傅立叶平面中进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述基层为盘片，并且通过旋转所述盘片来对所述基层进行扫描。
6.一种用于测定样品中是否存在靶分析物的正交干涉测量方法，所述方法包括
使用波长为λ、腰斑半径为w0的激光束来探测至少一部分基层，所述基层具有暴露给所述样品的反射表面，所述反射表面包括至少第一区域和第二区域，所述第一区域具有特定于所述靶分析物的识别分子层，所述第二区域不包括特定于所述靶分析物的识别分子层；
在探测所述第一区域和所述第二区域时，测量探测光束的反射衍射信号的一对正交角θq中的一个处的基本仅第一正交的光电检测器上的时间依赖强度。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述时间依赖产生于所述入射激光束相对于所述基层的相对运动。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基层为盘片，并且所述盘片相对于所述入射激光束的相对运动通过旋转所述盘片而产生。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过使用分式光电检测器配置来对所述激光束的反射衍射信号进行测量，所述方法还包括将对应于所述一对正交角中的一个处的所述反射信号的第一输出部分进行反转，并且将反转后的第一输出与对应于所述一对正交角中的另一个处的所述反射信号的第二输出相加。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述基层为盘片，并且在测量所述强度之前先将所述反射衍射信号通过一物镜。
11.根据权利要求7所述的方法，还包括在测量所述强度之前先将所述探测光束的反射衍射信号通过π/2相位掩模板。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述反射表面基本上是平的，并且所述正交角由正交于基层的光线通过以下公式来定义
θq＝sin-1(λ/2w0)。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述基层为盘片，并且所述盘片的反射表面包括多个槽和多个脊，所述脊的高度为h，并且所述正交角由正交于基层的光线通过以下公式来定义
θq＝sin-1[(λ/2-4h)/w0]。
14.一种测定样品中是否存在靶分析物的相位差正交干涉测量步阶检测方法，所述方法包括
使用分式光电检测器配置来测量由探测激光束入射到盘片上产生的反射光信号的远场衍射图样的时间依赖强度，所述盘片具有识别分子的空间图样，
将来自所产生的光信号的第一正交和第二反向正交的分量相加，在将所述分量相加之前先将所述第一正交的分量进行反转。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述强度通过从所述盘片的反射表面反射所产生的光信号来测量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述分式光电检测器配置是开环光电检测器。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述分式光电检测器配置是象限光电检测器。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述分式光电检测器配置包括第一和第二光电检测器，所述入射到盘片上的探测光束的波长为λ、腰斑半径为w0，所述第一和第二光电检测器测量在基本一对正交角θ q处的强度，所述正交角由正交于基层的光线通过以下公式来定义
θq＝sin-1(λ/2w0)。
19.根据权利要求15所述的方法，其中通过旋转所述盘片来对时间依赖强度进行测量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述盘片以约80Hz旋转。
21.一种测定样品中是否存在靶分析物的相位差正交干涉测量步阶检测方法，所述方法包括
对在基本仅第一正交的反射光信号的第一部分的基本第一正交干涉角处的时间依赖差异进行测量，所述反射光信号由对激光束进行追踪而产生，所述激光束穿越平面阵列上的特定抗体和非特定抗体的交替区域。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括对在基本仅第二正交的反射光信号的第二部分的基本第二正交干涉角处的时间依赖差别进行测量，所述反射光信号由对激光束进行追踪而产生，所述激光束穿越平面阵列上的交替区域。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括
将所述反射光信号的第一部分的第一输出进行反转；
将反转后的第一输出与所述反射光信号的第二部分的第二输出相加。
24.一种测定样品中有无靶分析物的无比例无标记正交干涉测量步阶检测方法，所述方法包括
使用入射腰斑半径为w0、波长为λ的聚焦激光束来扫描盘片，所述盘片具有特定于靶分析物的受体分子的空间图样层，所述层具有基本锐利的层边缘；
使用分式光电检测器配置来检测由扫描所述基本锐利的层边缘而引起的远场衍射图样中的强度变化，所述分式光电检测器装置提供在一对正交干涉角中的至少一个处的远场衍射图样的输出，所述正交干涉角由正交于基层的光线来定义。
25.一种测定样品中有无靶分析物的正交干涉测量步阶检测方法，所述方法包括
对排列在光学组件中的第一光电检测器的输出进行测量以接收反射光信号的基本仅第一正交，所述基本仅第一正交通过在基本第一正交角处观测所述反射光信号而产生，所述反射光信号通过波长为λ、腰斑半径为w0的探测激光束入射到平面阵列上而产生，所述平面阵列具有至少一个脊，所述脊由特定于靶分析物的受体分子层定义，其中正交角θq由正交于基层的光线通过以下公式来定义
θ q＝sin-1(λ/2w0)。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法还包括对排列在光学组件中的第二光电检测器的输出进行测量以接收基本仅第二反向正交，所述基本仅第二反向正交通过在基本第二正交角处观测所述反射光信号而产生。
27.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括
对所述第一光电检测器的输出进行反转；
将所述第一光电检测器的反转后的输出与所述第二光电检测器的输出相加。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述光学组件包括物镜。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一和第二光电检测器在傅立叶平面中对反射光信号的远场衍射图样进行测量。
30.一种用于对生物样品中是否存在靶分析物进行干涉检测的设备，所述设备包括
波长为λ、腰斑半径为w0的聚焦激光束的光源，所述光源被排列以直接或者间接地使所述激光束入射到基层上；
所述基层具有带有空间图样生物层的反射表面，所述生物层包括多个受体分子覆盖层，每一覆盖层被配置为绑定特定的靶分析物；
用于测量远场衍射图样的强度的分式光电检测器，所述分式光电检测器被定位以对基本仅在观测角上的强度进行检测，所述观测角与一对正交角中的至少一个基本相等，所述正交角由正交于基层的光线通过以下公式来定义
θq＝sin-1(λ/2w0)。
31.根据权利要求30所述的设备，其中所述分式光电检测器包括用于阻挡所述远场衍射图样的除在所述正交角处以外的部分的孔径。
32.根据权利要求30所述的设备，其中所述反射表面包括用作激光镜的10层Ti2O5/SiO2电介质堆叠。
33.根据权利要求30所述的设备，其中所述分式光电检测器是象限光电检测器，并且所述反射表面包括四分之一波长电介质堆叠。
34.一种用于检测平面阵列上有无靶分子的相位差正交干涉测量的设备，所述设备包括
激光光源，用于产生探测光束；
平台，用于容纳平面阵列；
第一光学组件，用于在所述平台处以基本表面正交方式引导所述探测光束；
具有第一侧面和第二侧面以及焦距的物镜，所述物镜在该物镜的第一侧面从所述平台偏移了近似等于所述焦距的第一距离；
分式光电检测器装置，所述分式光电检测器装置用于测量由所述探测光束的反射产生的信号中的第一正交和第二正交。
35.根据权利要求34所述的设备，其中所述平面阵列为盘片，并且其中所述设备还包括连接于所述平台的用于旋转所述盘片的旋转器。
36.根据权利要求34所述的设备，其中用于测量的所述分式光电检测器装置是象限光电检测器，所述象限光电检测器被定位以产生对于信号中的第一正交的第一输出和对于信号中的第二正交的第二输出。
37.根据权利要求36所述的设备，该设备还包括连接于所述第一输出与所述第二输出之一的反转电路，以及连接于所述反转电路和所述第一输出与第二输出之另一个的加法电路。
38.根据权利要求34所述的设备，其中用于测量的所述分式光电检测器装置为第一光电检测器和第二光电检测器，所述第一光电检测器被定位以产生对于信号中的第一正交的第一输出，所述第二光电检测器被定位以产生对于信号中的第二正交的第二输出。
39.根据权利要求35所述的设备，其中用于测量的所述分式光电检测器装置是开环光电检测器，所述开环光电检测器被定位以产生对于信号中的第一正交的第一输出和对于信号中的第二正交的第二输出。
40.根据权利要求34所述的设备，其中用于测量的装置从所述物镜的第二侧面偏移了近似等于所述焦距的第二距离。
41.一种用于检测样品中有无靶分析物的相位差正交干涉测量的系统，所述样品暴露在具有反射表面的盘片上，所述反射表面包括识别分子的多个空间图样覆盖层，至少一个识别分子特定于所述靶分析物，所述系统包括
平台，用于容纳所述盘片；
旋转器，用于旋转所述盘片；
波长为λ的聚焦激光束的光源，所述光源被排列以直接或者间接地使所述激光束以腰斑半径w0入射到所述盘片上；
用于追踪所述激光束越过所述识别分子的多个空间图样覆盖层的装置；
分式光电检测器装置，所述分式光电检测器装置用于测量基本远场衍射图样的一对正交干涉角θq处的强度，所述远场衍射图样由追踪所述激光束越过所述平面阵列而产生，所述正交干涉角θq通过以下公式来定义
θq＝sin-1(λ/2w0)。
42.根据权利要求41所述的系统，该系统还包括物镜，所述物镜被定位在所述平台上的所述盘片和用于测量强度的所述分式光电检测器装置之间。
43.根据权利要求41所述的系统，其中用于测量强度的所述分式光电检测器装置具有第一输出和第二输出，所述第一输出与在所述一对正交干涉角θq中的一个处的强度对应，所述第二输出与在所述一对正交干涉角θq中的另一个处的强度对应。
44.根据权利要求43所述的系统，该系统还包括连接于所述第一输出与所述第二输出之一的反转电路，以及连接于所述反转电路和所述第一输出与第二输出之另一个的加法电路。
45.根据权利要求43所述的系统，其中用于测量的所述分式光电检测器是象限光电检测器。
全文摘要
一种用于测定样品中有无靶分析物的相位差正交干涉测量方法，包括使用波长为λ、腰斑半径为ω的光束检测具有暴露给样品的反射表面的至少一部分基层。反射表面包括至少第一区域和第二区域。所述方法还包括在探测第一区域和第二区域时测量探测光束的反射衍射信号的一对正交角θq中的一个处的基本仅第一正交的光电检测器上的时间依赖强度。一种用于检测平面阵列上是否存在靶分子的相位差正交干涉测量的装置，包括用于产生探测光束的激光源、用于容纳平面阵列的平台以及在平台处以基本表面正交方式引导探测光束的第一光学组件。所述装置还包括具有第一侧面、第二侧面以及焦距的物镜。所述装置还包括用于测量第一正交和第二正交的分式光电检测器装置。
文档编号G01N21/45GK101151518SQ200680010583
公开日2008年3月26日 申请日期2006年2月1日 优先权日2005年2月1日
发明者D·诺尔蒂, 彭蕾蕾, F·E·雷尼尔, 明 赵 申请人:普渡研究基金会