反应容器中的分注方法及反应容器处理装置的制作方法

专利名称：反应容器中的分注方法及反应容器处理装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用适于以化学反应为主、在医疗现场等进行各种自 动分析例如基因分析的研究或临床的反应容器，用于检测以人为主以及动物或植物的基因组DNA的多态性、特别是SNP (单碱基多态性)的反应 容器处理装置。可以使用检测出的基因多态性检测结果进行患病率的诊 断、给药的种类与效果及副作用的关系的诊断等。
背景技术：
作为利用基因多态性来预测疾病的患病容易度等的方法或装置，提出 了如下所述的方法或装置。为了决定患者是否容易患上败血病及/或败血病是否快速进展，从患 者身上采集核酸样品，检测该样品中的2型(pattern)等位基因或与2型 等位基因连锁不平衡的标记基因，如果检测出2型等位基因或与2型等位 基因连锁不平衡的标记基因，则判断为该患者容易患败血病(参照专利文 献1。)。为了诊断人的flt—l基因中的1或1以上的单核苷多态性，通过决定 人核酸的1或1以上的位置1953、 3453、 3888 (分别按照EMBL受理 编号X51602中的位置)、519、 786、 1422、 1429 (分别按照EMBL受理 编号D64016中的位置)、454 (按照序列编号3)及696 (按照序列编号5) 的序列，参照flt—1基因中的多态性，决定此人的体质(参照专利文献2。)。有关于鉴别SNP位点的碱基即分型的很多手法的报道。下述方法为其中具有代表性的手法。为了使用较少量的基因组DNA，对涉及到数十万处的SNP位点进行 分型，使用基因组DNA及多对引物同时扩增至少包括一个单碱基多态性 位点的多个碱基序列，使用扩增后的多个碱基序列，利用分型工序辨别该
碱基序列中含有的单碱基多态性位点的碱基。作为该分型工序，使用侵入(invader)法或荧光定量PCR法(Taqman PCR法)(参照专利文献3。)。 专利文献1: JP特表2002 — 533096号公报 专利文献2: JP特开2001—299366号公报 专利文献3: JP特开2002—300894号公报 专利文献4: JP专利第3452717号公报本发明人等提出了一种以化学反应的测定或自动地检测基因多态性 为目的，适于自动进行化学反应的测定或基因多态性检测的反应容器。该反应容器至少具备设有多个使样品反应的反应孔(well)的反应部。 使用时将比重低于反应液的矿物油等不挥发性液体分注于反应孔从而覆 盖反应液的表面。这样的反应容器为基因多态性诊断用反应容器的情况下，反应孔的尺 寸例如微小至直径100pm 2mm,深50, 1.5mm。向这样的反应孔中分注反应液例如微量达0.1 5|iL左右。如果想用 喷嘴分注这样微量的反应液，有时在喷嘴的顶端附着液体，不能顺利地分 注到反应孔中。另外，如果想要使喷嘴的顶端接触反应孔再使反应液向反 应孔移动，那么在配置反应相关的物质的情况下，喷嘴的顶端如果接触反 应孔的底面则会发生污染。在反应孔中，为了防止在反应中反应液挥发而分注矿物油等不挥发性 液体。此时，该不挥发性液体的分注量也微量至例如1 10&左右，而且 不挥发性液体的粘度高，不能从喷嘴顶端分离液体，难以正确地分注。如 果在反应孔内以不挥发性液体不能覆盖反应液的上面从而露出的状态下 进行反应，则反应中存在反应液蒸发从而不能进行精密度良好的测定的问 题。另外，先分注反应液，再从其上分注不挥发性液体的情况下，分注不 挥发性液体时的喷嘴的顶端如果与其顶端接触会发生污染。发明内容本发明的目的在于能够容易地向反应容器的反应孔分注反应液和不 挥发性液体。
本发明的分注方法是向至少具备设有多个使样品反应的反应孔的反 应部的反应容器的反应孔中，利用喷嘴先后分注反应液和比重低于反应液 的不挥发性液体的分注方法。反应液和不挥发性液体均可以先分注。先分注的液体的分注工序是在喷嘴的顶端形成该液体的液滴，使该液 滴接触反应孔的底面或内壁面向反应孔内移动的方法。后分注的液体的分注工序的第1方法是挤压使喷嘴的顶端接触反应 孔的内壁面，使该液体顺着该内壁面向反应孔内移动的方法。后分注的液体的分注工序的第2方法是在喷嘴的顶端形成该液体的 液滴，使该液滴接触反应孔的内壁面或先注入到反应孔的液体的表面向反 应孔内移动的方法。虽然反应液和不挥发性液体均可以先分注，但为了用不挥发性液体良 好地覆盖反应液的表面，优选先分注的液体为反应液。反应容器的优选例为一体具备收容了不挥发性液体的不挥发性液体 收容部的反应容器。反应容器的进一步优选例为还一体具备收容分型试剂的分型试剂收 容部，作为反应部的反应孔具备分别保持与多个多态性位点分别对应而发 出荧光的探针的探针配置部的基因多态性诊断用反应容器。反应容器的进一步优选例为还一体具备收容含有夹着多个多态性位 点进行结合的多个引物的基因扩增试剂的基因扩增试剂收容部和相对基 因扩增试剂和样品的混合液进行基因扩增反应的扩增反应部的基因多态 性诊断用反应容器。喷嘴在顶端安装装卸自如的喷头，可以借助该喷头进行液体的分注。 在本发明中，将在喷嘴的顶端安装有喷头的状态的喷嘴称为含头喷嘴。作为比重低于反应液的不挥发性液体，可以使用矿物油(石油)、植 物油、动物油、硅油或二苯醚等。矿物油是从凡士林蒸馏得到的液体的烃 混合物，也被称为液体石蜡、液体凡士林、白油等，也包括低比重的轻油。 作为动物油，可以使用鳕鱼肝油、狭鳞庸鲽油、鲱鱼油、罗非鱼(Orange roughy)油或鳖鱼肝油等。另外，作为植物油，可以使用卡诺拉(canola) 油、杏仁油、绵籽油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、豆油 等。本发明的反应容器处理装置至少具备安装有至少具备设有多个使样 品发生反应的反应孔的反应部的反应容器的反应容器安装部；和如图1所 示使用于吸引及喷出的喷嘴28移动，进行反应容器的液体的移送的分注 部112;和至少对分注部112的分注动作进行控制，控制部118执行本发 明的分注方法。为了从外部操作控制部118或显示检查结果，也可以使个人电脑(PC) 122与控制部118连接。在本发明中，先分注的液体在喷嘴的顶端形成该液体的液滴，使该液 滴接触反应孔的底面或内壁面，使其向反应孔内移动，后分注的液体挤压 使喷嘴的顶端接近反应孔的内壁面，使该液体顺着该内壁面向反应孔内移 动，或者在喷嘴的顶端形成该液体的液滴，使该液滴接触反应孔的内壁面 或先注入到反应孔的液体的表面，使其向反应孔内移动，所以可以正确地 进行反应液的微量分注而且没有污染。另外，不挥发性液体也可以正确地 分注，而且分注时没有污染。其结果，可以在反应孔用不挥发性液体覆盖 反应液的表面，不会发生反应时的反应液的干燥，可以精密度很好地进行


图1是概要地显示本发明的框图。 图2A是反应容器的第1例的正面图。 图2B是反应容器的第1例的俯视图。图3A是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的 正面图。图3B是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的 俯视图。图4A是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的 正面图。图4B是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的 俯视图。图5A是反应容器的第2例的正面图。图5B是反应容器的第2例的俯视图。图5C是表示反应容器的第2例的图，是在图5B的X—X线位置剖 开的截面图。图6A是将同一反应容器中的基因扩增扩增反应部在图5B的Y—Y 线位置剖开的截面图，其为反应液被注入的状态。图6B是将同一反应容器中的基因扩增扩增反应部在图5B的Y—Y 线位置剖开的截面图，其为反应液被回收的状态。图7A是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的 正面图。图7B是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的 俯视图。图8A是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的 正面图。图8B是表示使用同一反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的 俯视图。图9是表示本发明的反应容器处理装置的一个实施例的概要截面图。 图IO是表示同一实施例中的分型反应部的截面图。 图11A是表示液体向探针配置部的分注方法的实施例的截面图，其 是分注反应液的情况。图11B是表示液体向探针配置部的分注方法的实施例的截面图，其 是分注矿物油的情况。图11C是表示液体向探针配置部的分注方法的实施例的截面图，其 是分注矿物油的情况。图12是表示同一实施例中的荧光检测部的概要结构图。 图13是概要地表示本发明相关的SNP检测方法的流程图。 图中，2 —样品，4一PCR反应试剂，6—侵入试剂，8—探针配置部， 10、 10a—基板，12—样品注入部，14一分型试剂收容部，16—矿物油收 容部，18—探针配置部，20—薄膜，22—密封材料，28 —喷嘴，30—基因 扩增试剂收容部，31—PCR中止液注入部，32—基因扩增反应部，40—矿 物油，40a—矿物油的液滴，41一反应容器，60、 62 —加热模块，64 —荧 光检测部，66 —送液臂，70 —喷头，112 —分注部，118 —控制部，170 — 反应液，170a—反应液的液滴。
具体实施方式
图2A及图2B是本发明的反应容器处理装置中使用的反应容器的第 l例。图2A为正面图，图2B为俯视图。在平板状的基板10的同一侧，试剂收容部14及不挥发性液体收容部 16形成为凹部。以下将矿物油用作不挥发性液体。将不挥发性液体收容 部称为矿物油收容部。在基板10的同一侧进而还形成反应部18。试剂收 容部14和矿物油收容部16被薄膜20密封，在用喷嘴吸入试剂和矿物油 并移送至其他场所时，去除该薄膜20用喷嘴吸入，或者可以用喷嘴穿透 该薄膜20时使喷嘴穿透该薄膜，用喷嘴吸入。从薄膜20上，用大小为覆盖试剂收容部14、矿物油收容部16及反 应部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10的表面。作为该反应容器的具体用途的一例，为注入利用PCR反应扩增DNA 的样品反应液并利用侵入反应检测SNP的基因多态性诊断用试剂盒。在此，如果表示多态性位点与引物的关系，则是为了扩增一个多态性 位点而必需夹着该多态性位点进行结，的一对引物。成为对象的生物体样 品中存在多种多态性位点，所以在这^多态性位点存在于彼此分离的位置 的情况下，必需多态性位点的种类的数目的2倍种引物。不过，2个多态 性位点接近的情况下，分别夹着这些多态性位点结合引物扩增也可以在这 2个多态性位点之间不结合引物，而只在2个多态性位点的序列的两侧结 合引物扩增。因而，必要的引物种类不一定需要为多态性位点的种类的数 目的2倍。本发明中的"夹着多个多态性位点中各个多态性位点进行结合 的多个引物"不只包括一对引物夹着1个多态性位点进行结合的情况，也 包括夹着2或2以上的多态性位点进行结合的情况，是指扩增多个多态性 位点所必需的种类的引物。多态性包括变异、缺失、重复、转移等。具有代表性的多态性是SNP。生物体样品为血液、唾液、基因组DNA等。扩增工序可以使用PCR法等。这种情况下，优选在25°C下pH为8.5 9.5的条件下进行PCR法。这种情况下，基因扩增试剂为PCR反应试剂。 SNP的分型中，在进入扩增工序的阶段必须调整基因组DNA，其中 需要花费时间、人力和成本。如果只着眼于扩增DNA的PCR法，还提出 了不用进行前处理而从血液等样品直接进行PCR反应的方法。于是，在 扩增含有基因的样品中的目的基因的核酸合成法中，向基因扩增反应液中 添加含有基因的样品中的基因包含体或含有基因的样品本身，添加后的该 反应液的pH在为8.5 9.5 (25'C)下，扩增含有基因的样品中的目的基 因(参照专利文献4。)。已经构建的分型系统，为了用PCR法扩增要进行分型的多个SNP区 域，虽然最初采集的DNA量很少即可，但在PCR法扩增之前，必需进行 预先从生物体样品中提取DNA的前处理。为此该前处理需要花费时间和 人力。在将直接PCR法与分型方法结合起来时，对需要进行分型的多个SNP 位点同时进行扩增的自动化系统尚未构建起来。所述分型工序可以使用侵入法或荧光定量PCR法。这种情况下，分 型试剂为侵入试剂或荧光定量PCR试剂。图13是概要地表示本发明的反应容器处理装置也有时执行的基因多 态性检测方法的图。在此，按照扩增工序使用PCR法、分型工序使用侵 入法进行说明。在PCR工序中，向血液等生物体样品2中添加PCR反应试剂4，或 相反，向PCR反应试剂4中添加生物体样品2。例如采集lpL生物体样 品2，向其中添加10pL左右PCR反应试剂4。 PCR反应试剂4被预先调 整，含有用于要测定的SNP位点的多个引物，向其中添加用于调节pH的 缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)、其他必要的i^式剂， 在与样品2混合时将pH调整至8.5 9.5。使生物体样品2与PCR反应试剂4的混合液，按照规定的温度循环 进行PCR反应。PCR温度循环包括改性、引物附着(退火(annealing)) 及引物延伸的3个工序，通过反复进行该循环，使DNA扩增。作为各工 序的一例，改性工序为94i:下l分钟，弓(物附着工序为55'C下1分钟， 引物延伸为72'C下1分钟。生物体样品可以为实施了基因组提取操作的
样品，但在此也可以使用没有实施基因组提取操作的样品。即使是没有实施基因组提取操作的生物体样品，也可以在PCR温度循环的高温下，DNA 从血细胞或细胞游离出来，PCR反应所必需的试剂与DNA接触，反应进行。PCR反应结束后，添加作为分型试剂的侵入试剂6。侵入试剂6中含 有发出荧光的FRET探针及切割酶(cleavase:结构特异的DNA分解酶)。 FRET探针是具有与基因组DNA完全没有关系的序列的荧光标记寡核苷 酸，无论SNP的种类如何，序列大多共用。接着，向分型反应部的多个探针配置部8中添加已添加侵入试剂6的 反应液，使其反应。在各探针配置部8，分别对应各多个SNP位点保持侵 入探针和报告(reporter)探针，反应液与侵入探针反应，只要存在对应 该报告探针的SNP，就可以发出荧光。在专利文献3的段落

中有关于侵入法的详细记载。各报告探针只要根据与其对应的SNP碱基准备2种，就可以辨别出 该SNP为纯合子还是杂合子。有时在本发明中使用的扩增工序的PCR法是同时使需要的多个SNP 位点扩增的方法，而且利用直接PCR法从没有实施核酸提取操作的生物 体样品中扩增含有这些SNP位点的多个基因组DNA。所以，使含有用于 这些SNP位点的多个引物的基因扩增反应试剂作用于生物体样品，使其 在25。C下的pH成为8.5 9.5的条件下发生PCR反应。PCR反应试剂含有pH缓冲液、MgCl2、 KC1等盐类、弓l物、脱氧核 糖核苷酸类、热稳定性合成酶。此外，还可以根据需要添加表面活性剂或 蛋白等物质。除了三(羟甲基)氨基甲烷与盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的组合以外， pH缓冲液还可以使用各种pH缓冲液。在PCR反应试剂中，优选以 10mM 100mM的浓度使用已调整pH的缓冲液。引物是指作为起到利用PCR反应合成DNA的开始点作用的寡核苷 酸。引物可以合成，也可以从生物界中分离。合成酶是通过附加引物来合成DNA用的酶，也包括化学合成系。作 为适当的合成酶，包括大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase))的DNA聚合酶的Klenow fragment、 T4DNA聚合 物、TaqDNA聚合酶、T. litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfUDNA 聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KODDNA聚合酶、EXTaqDNA聚合酶、逆转录酶等，但不仅于这些。"热稳定性"是指即使在高温下、最好在 65 95"C下也可以保持其活性的化合物的性质。在分型工序中使用的侵入法是通过使等位基因特异寡核苷酸与含有 分型对象的SNP的DNA发生杂交(hybridyzation)，来分型SNP位点的 方法，是使用如下所述物质的方法，即含有分型对象的SNP的DNA、 对含有分型对象的SNP的各等位基因特异的2种报告探针及1种侵入探 针、和识别DNA结构并切断的具有特殊内切酶(endonuclease)活性的酶 (参照专利文献3。)。下面进行反应容器的具体说明。参照图2A及图2B，详细说明该基 因多态性诊断用试剂盒的实施例。在平板状的基板10的同一侧，样品注入部12、分型试剂收容部14 及矿物油收容部16形成为凹部。在基板10的同一侧，进而还形成多个探 针配置部18。样品注入部12是注入利用PCR反应扩增DNA的生物体样品反应液 的部位，以在使用前的状态下尚未注入样品的空的状态提供。分型试剂收 容部14收容10 300^iL左右对应多个多态性位点配制的分型试剂，矿物 油收容部18收容20 300pL用于防止反应液的蒸发的矿物油，这些分型 试剂收容部14和矿物油收容部18被喷嘴可以穿透的薄膜20密封。这样 的薄膜20例如为铝箔、铝与PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯)薄膜等树脂 薄膜的层叠膜等，为了不容易剥落，利用熔融或粘接贴附。各探针配置部18分别保持对应各多个多态性位点并发出荧光的探 针，成为可以在从矿物油收容部16分注矿物油时保持该矿物油的凹部。 各探针配置部18的凹部的尺寸例如为直径100pm 2mm、深5CHim 1.5mm的圆形。从薄膜20上，用大小为覆盖样品注入部12、分型试剂收容部14、矿 物油收容部16及探针配置部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10的 表面。该密封材料22也可以为铝箔、铝与PET薄膜等树脂的层叠膜等， 但贴附强度比薄膜20弱，所以利用粘合剂等贴附成可以剥离的程度。为了从底面侧测定荧光，用低自荧光性(很少从其自身产生荧光的性质)而且光透过性的树脂例如聚碳酸酯等原材料形成基板10。基板10的 厚度为1 2mm。下面显示该反应容器的使用方法。如图3A及图3B所示，使用时剥下密封材料22。密封分型试剂收容 部14和矿物油收容部18的薄膜20不被剥下而残留不变。利用吸量管26等向样品注入部12注入2 20mL已在外部利用pcr 反应扩增DNA的样品反应液24。然后，将该反应容器安装于检测装置。在检测装置中，如图4A及图4B所示，喷嘴28穿透薄膜20插入分 型试剂收容部14吸入分型试剂，分型试剂被该喷嘴28移送至样品注入部 12。通过在样品注入部12反复进行喷嘴28的吸入和喷出，使样品反应液 与PCR反应试剂混合。然后，利用喷嘴28向各探针配置部18以0.5 4pL逐次分注样品反 应液与分型试剂的反应液。从矿物油收容部18利用喷嘴28向各探针配置 部18逐次分注0.5 10pL矿物油。矿物油向探针配置部18的分注也可以 在反应液向探针配置部18分注之前进行。在各探针配置部18，该矿物油 覆盖反应液的表面，防止伴随着检测装置的分型反应部的加热而分型反应 时间中的反应液的蒸发。在各探针配置部18，反应液只要有与探针反应的规定的snp，就会 从该探针发出荧光。通过从基板io的背面侧照射激发光来检测出荧光。图5A、图5B及图5C是本发明的反应容器处理装置中使用的反应容 器的第2例。图5A是正面图，图5B是俯视图，图5C是在基因扩增反应 部的X—X线位置的截面图。该反应溶液将没有实施核酸提取操作的生物体样品作为样品注入，同 时进行利用PCR反应的DNA的扩增和利用侵入反应的SNP检测。其中， 也可以注入没有实施核酸提取操作的生物体样品。与图2A及图2B的反应容器同样，在平板状的基板10a的同一侧形 成样品注入部12、分型试剂收容部14、矿物油收容部16及多个探针配置 部18。在该反应容器中进而在基板10a的同一侧形成基因扩增试剂收容
部30、 PCR中止液注入部31及基因扩增反应部32。基因扩增试剂收容部30也在基板10a形成为凹部，收容含有夹着多 个多态性位点中各个多态性位点进行结合的多个引物的基因扩增试剂。基 因扩增试剂收容部30与分型试剂收容部14及矿物油收容部16 —起用可 以被喷嘴穿透的薄膜20密封。在基因扩增试剂收容部30中收容2 300(iLPCR反应试剂。与图2A及图2B的反应容器同样，在分型试剂收 容部14收容10 300pL分型试剂，在矿物油收容部16收容20 300pL 矿物油。PCR中止液注入部31是用于混合在基因扩增反应部32中止PCR反 应的反应液与分型试剂的部位，在基板10a形成为凹部，以使用前的状态 为空的状态提供。基因扩增反应部32是对PCR反应试剂和样品的混合液进行基因扩增 反应的部位。图6A及图6B表示放大基因扩增反应部32的部分截面。图6A及图 6B是在图5B的Y—Y线位置剖开的截面图。如图6A及图6B所示，基 因扩增反应部32的液体分注用喷口 34a、 34b具有对应喷嘴28的顶端形 状的形状的开口 36a、36b，为了可以与喷嘴28的顶端贴紧而用PDMS(聚 二甲基硅氧烷)或硅酮橡胶等弹性原材料构成。基因扩增反应部32为了使热传导系数很好而该部分的基板10a的下 面侧如图5C、图6A及图6B所示，壁厚变薄。该部分的壁厚例如为0.2 0.3mm。样品注入部12在该反应容器中被注入没有实施核酸提取操作的生物 体样品，但以使用前的状态尚未注入样品的空的状态提供。与图2A及图2B的反应容器相同，分型试剂收容部14收容对应多个 多态性位点配制的分型试剂，矿物油收容部18收容用于防止反应液的蒸 发的矿物油。各探针配置部18也与图2A及图2B的反应容器相同，分别保持对应 各多个多态性位点发出荧光的探针，成为在从矿物油收容部16分注矿物 油时可以保持该矿物油的凹部。从薄膜20上，用大小为覆盖样品注入部12、 PCR中止液注入部31、分型试剂收容部14、矿物油收容部16、基因扩增试剂收容部30、基因扩 增反应部32及探针配置部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10a的 表面。薄膜20与密封材料22的材质及其贴附方法与图2A及图2B的反 应容器相同。为了从底面侧测定荧光，也用低自荧光性而且光透过性的树脂例如聚 碳酸酯等原材料形成基板10a。基板10的厚度为1 2mm。 下面显示该例的反应容器的使用方法。如图7A及图7B所示，使用时剥下密封材料22。密封分型试剂收容 部14、矿物油收容部18及基因扩增试剂收容部30的薄膜20不被剥下而 残留不变。利用吸量管26等向样品注入部12注入0.5 2|iL样品25。在图2A 及图2B的反应容器中，注入的样品为在外部利用PCR反应扩增DNA的 样品反应液，但在该反应容器中注入的样品为没有实施核酸提取操作的生 物体样品例如血液。样品也可以为实施了核酸提取操作的生物体样品。注 入样品之后，将该反应容器安装于检测装置。在检测装置中，如图8A及图8B所示，喷嘴28穿透薄膜20插入基 因扩增试剂收容部30吸入PCR反应试剂，2 20^LPCR反应试剂被该喷 嘴28移送至样品注入部12。通过在样品注入部12反复进行喷嘴28的吸 入和喷出，使样品反应液与PCR反应试剂混合，成为PCR反应液。接着，如图6A所示，该PCR反应液被喷嘴28分注到扩增反应部32。 即，喷嘴28插入扩增反应部32的一方的喷口 34a，注入该PCR反应液 38，接着，为了防止在扩增反应部32的反应中PCR反应液38蒸发，利 用喷嘴38向喷口34a、 34b注入矿物油40，用矿物油40覆盖在喷口 34a、 34b的PCR反应液38的表面。在分注该矿物油40时，利用本发明，在喷嘴的顶端形成由矿物油40 构成的液滴，使喷嘴移动，接近喷口34a、 34b，使矿物油40构成的液滴 接触喷口34a、 34b的底面或壁面，进行分注。在此，由矿物油40构成的液滴，可以按照该液滴接触喷口 34a、 34b 的底面或壁面的程度使喷嘴接近喷口34a、 34b之前，在喷嘴的顶端形成， 也可以在使喷嘴接近喷口 34a、 34b之后形成。 PCR反应中止后，利用喷嘴28回收PCR反应液，但此时为了容易回 收，如图6B所示，从基因扩增反应部32的一方喷口34a注入矿物油40。 反应中止后的PCR反应液38a被压向另一方喷口 34b。因此，插入该喷嘴 28， PCR反应液38a被吸入到喷嘴28。喷口 34a、 34b形成为其开口 36a、 36b的形状与喷嘴28的形状一致，而且用弹性原材料形成，所以喷嘴28 与喷口34a、 34b贴紧，防止液体漏出，容易进行PCR反应液的注入和回 收的操作。利用喷嘴28，从基因扩增反应部32回收的反应中止后的PCR反应 液38a被移送至PCR中止液注入部31 。接着，喷嘴28穿透薄膜20插入分型试剂收容部14，吸入分型试剂， 分型试剂被该喷嘴28移送并被注入PCR中止液注入部31。在PCR中止 液注入部31，通过反复进行喷嘴28的吸入和喷出，混合PCR反应液和分 型试剂。然后，将PCR反应液与分型试剂的反应液被喷嘴28以0.5 4pL逐 次分注到各探针配置部18。从矿物油收容部18利用喷嘴28向各探针配 置部18逐次分注0.5 10pL矿物油。矿物油向探针配置部18的分注也可 以在反应液向探针配置部18分注之前。在各探针配置部1S，矿物油覆盖 反应液的表面，防止伴随着在检测装置的分型反应部的加热而分型反应时 间中的反应液的蒸发。在各探针配置部18，反应液只要有与探针反应的规定的SNP，就会 从该探针发出荧光。通过从基板10的背面侧照射激发光来检测出荧光。以下显示各反应试剂的组成，详细说明本发明，但本发明的技术范围 不限于这些反应容器。PCR反应试剂为已知的试剂，例如可以使用如专利文献3的段落
中记载的含有引物、DNA聚合酶及TaqStart (CLONTECH Laboratories 公司制)的反应试剂。另外，也可以在PCR反应试剂中混入AmpDirect (岛津制作所制)。引物例如可以使用在专利文献3的表1中记载的SNP ID1 20、序列编号1 40等。作为分型试剂使用侵入试剂。作为该侵入试剂，使用侵入检测试剂盒 (invader assay kit: Third Wave Technology公司制)。例如，将信号缓冲 液(signal buffer) 、 FRET探针、结构特异DNA分解酶及等位基因特异 探针配制成如专利文献3的段落
中记载的浓度。图9是表示将上述反应容器用作试剂盒，将本发明适用于检测生物体 样品的SNP的简易型反应容器处理装置的一个实施例的图。在装置内上下配置一对加热模块60和62，构成检查试剂盒安装部， 在下侧加热模块60上平行地并列设置5张向本发明的反应容器41中注入 样品的反应容器。这些加热模块60、 62可以向箭头所示的Y方向移动。如图10所示，检查试剂盒安装部在下侧的加热模块60上具备使反应 容器41滑动并在规定的位置定位的引导部。下侧的加热模块60构成将基 因扩增反应部32的温度控制成规定的温度循环的扩增部(未图示)。另 外，还具备利用两加热模块60、 62而将探针配置部18的温度控制成使 DNA与探针反应的温度的分型反应部。扩增部和分型反应部在图1中分 别用符号120、 IIO表示。扩增部的温度例如被设定成在94t、 55'C及72 。C的3个阶段依次变化，重复进行该循环。分型反应部的温度例如被设定 成63。C。构成分型反应部的上侧的加热模块62只在对应探针配置部的位置具 有开口 150，在下侧加热模块60，构成分型反应部的部分也只在对应探针 配置部的位置具有开口 152。在加热模块62上覆盖分型反应部罩子154， 在该罩子154也只在加热模块62的开口 152的位置打开开口 156。在加热模块60的下部设置进行荧光检测的荧光检测器64，荧光检测 器64从反应容器41的下面侧借助加热模块60的开口 152向探针配置部 照射激发光，在反应容器41的下面侧借助加热模块60的开口 152检测来 自探针配置部的荧光。荧光检测部64向图9的箭头X方向移动，检测来 自探针配置部18的荧光。利用检查试剂盒安装部的探针配置部18的Y 方向移动和荧光检测器64的X方向移动，进行在各探针的荧光检测。回到图9进行说明，为了进行利用喷嘴28的液体的吸入和喷出，作 为分注部设置在X方向、Y方向及Z方向移动的送液臂66，送液臂66 具备喷嘴28。喷嘴28在其顶端装卸自如地安装一次性喷头70。分注部在 图1中用符号112表示。如图10所示，分注部的喷嘴28借助罩子154的开口 156和加热模 块62的开口 150向探针配置部分注反应液。回到图9进行说明，为了控制加热模块60、 62、荧光检测部64及送 液臂66的动作，在它们的附近配置控制部118。控制部118具备CPU， 保持用于动作的程序。控制部118控制利用加热模块60、 62实现的分型 反应部110或扩增部120的温度控制、荧光检测部64的检测动作及分注 部112的送液臂66的分注动作。在作为反应容器41使用图2A及图2B的反应容器那样的不具备基因 扩增反应部的反应容器的情况下，不需要控制基因扩增反应部的温度的扩 增部，扩增部18也不需要具备用于控制扩增部的温度的功能。图IIA、图11B及图11C表示反应液170和矿物油40向探针配置部 18的分注方法的图。在此，以先分注反应液170后向该反应液170之上 分注矿物油40的情况为例进行说明。但是，分注的顺序也可以相反。图11A为表示先向探针配置部18分注反应液170的方法的图。在喷 嘴的喷头70的顶端形成反应液170的液滴170a，使该液滴170a接触探 针配置部18的反应孔的底面或内壁面，再使其向反应孔内移动。图11B为表示在先向探针配置部18分注的反应液170上分注矿物油 40的第1方法的图。挤压使喷嘴的喷头70的顶端接近探针配置部18的 反应孔的内壁面使矿物油40顺着其内壁面向反应孔内移动。图11C为表示在先向探针配置部18分注的反应液170上分注矿物油 40的第2方法的图。在喷嘴的喷头70的顶端形成矿物油40的液滴40a， 使该液滴40a接触反应孔的内壁面或先分注于反应孔的反应液170的表 面，再使其向反应孔内移动。即使先分注矿物油40后再分注反应液170，由于比重，也会成为矿 物油40覆盖反应液170的表面的状态。图12是具体地表示荧光检测器64的图。荧光检测器64具备发出 473nm的激光的激光二极管(laser diode) (LD)或发光二极管(LED) 92作为激发光源，具备使该激光聚光、照射于反应容器41的探针配置部 的底面的一对透镜94、 96。透镜94使来自激光二极管92的激光聚光成 为平行光，透镜96是使变为平行的激光会聚、照射于反应容器41的底面 的物镜。物镜％还起到使从反应容器41产生的荧光聚光的透镜的作用。
在一对透镜94、 96之间设有分色镜(dichroic mirror) 98，分色镜98的波 长特性被设定为使激发光透过、使荧光反射。在分色镜98的反射光(荧 光)的光程上进一步设置分色镜100。分色镜100的波长特性被设定为反 射525nm的光、透过605nm的光。在分色镜100的反射光的光程上配置 有检测525nm的荧光的透镜102和光检测器104，在分色镜100的透过光 的光程上配置有检测605nm的荧光的透镜106和光检测器108。通过利用 此两个检测器104、 108检测2种荧光，检验对应固定于各探针配置部位 置的侵入探针的SNP的有无，和该SNP为纯合子还是杂合子。作为标记 荧光体，可以使用例如FAM、 ROX、 VIC、 TAMRA、 Redmond Red等。 图12的检测器64构成为在光源的激发光下激发，测定2波长的荧光， 但为了测定2波长的荧光而可以用不同的激发波长激发，作为检测器64 也可以构成为使用2个光源。产业上的可利用性本发明除了各种化学反应的测定以外，例如可以在基因分析的研究或 临床领域用于各种自动分析，例如可以检测以人为主以及动物或植物的基 因组DNA的多态性、特别是SNP (单碱基多态性)，进而可以用于使用 该结果进行患病率的诊断、给药的种类与效果及副作用的关系的诊断等， 此外还可以用于动物或植物的品种判定、传染病诊断(感染菌的型判定) 等。
权利要求
1.一种分注方法，其向至少具备设有多个使样品反应的反应孔的反应部的反应容器的所述反应孔中，利用喷嘴先后分注反应液和比重低于反应液的不挥发性液体，其特征在于，先分注的液体的分注工序在喷嘴的顶端形成该液体的液滴，使该液滴接触所述反应孔的底面或内壁面并向反应孔内移动。
2. —种分注方法，其向至少具备设有多个使样品反应的反应孔的反 应部的反应容器的所述反应孔中，利用喷嘴先后分注反应液和比重低于反 应液的不挥发性液体，其特征在于，后分注的液体的分注工序挤压使喷嘴的顶端接触所述反应孔的内壁 面，使该液体顺着该内壁面向反应孔内移动。
3. —种分注方法，其向至少具备设有多个使样品反应的反应孔的反 应部的反应容器的所述反应孔中，利用喷嘴先后分注反应液和比重低于反 应液的不挥发性液体，其特征在于，后分注的液体的分注工序在喷嘴的顶端形成该液体的液滴，使该液滴 接触所述反应孔的内壁面或先注入到反应孔的液体的表面并向反应孔内 移动。
4. 根据权利要求1 3中任意一项所述的分注方法，其中， 先分注的液体为反应液。
5. 根据权利要求1 4中任意一项所述的分注方法，其中， 所述反应容器一体具备收容了所述不挥发性液体的不挥发性液体收容部。
6. 根据权利要求1 5中任意一项所述的分注方法，其中， 所述反应容器是基因多态性诊断用反应容器，所述反应容器还一体具备收容了分型试剂的分型试剂收容部，作为所述反应部的反应孔具备探针 配置部，该探针配置部分别保持与多个多态性位点分别对应并发出荧光的 探针。
7. 根据权利要求1 6中任意一项所述的分注方法，其中，所述反应容器是基因多态性诊断用反应容器，所述反应容器还一体具 备收容基因扩增试剂的基因扩增试剂收容部和相对所述基因扩增试剂和 样品的混合液进行基因扩增反应的扩增反应部，所述基因扩增试剂含有夹 着多个多态性位点中各个多态性位点进行结合的多个引物。
8. 根据权利要求1 7中任意一项所述的分注方法，其中， 所述不挥发性液体为从矿物油、植物油、动物油、硅油及二苯醚构成的组中选择的液体。
9. 一种反应容器处理装置，其特征在于，至少具备反应容器安装部，其安装反应容器，该反应容器至少具备设有多个使样品发生反应的反应孔的反应部；和分注部，使用于吸引及喷出的喷嘴移动，进行所述反应容器的液体的 移送；和控制部，至少对所述分注部的分注动作进行控制，执行权利要求l 4中任意一项所述的分注方法。
全文摘要
一种反应容器中的分注方法及反应容器处理装置，可以容易地分注微量的不挥发性液体。优选的方式为在先向探针配置部(18)分注的反应液(170)上分注矿物油(40)时，在喷嘴的喷头(70)的顶端形成矿物油(40)的液滴(40a)，使该液滴(40a)接触反应孔的内壁面或先分注到反应孔的反应液(170)的表面而使其向反应孔内移动。
文档编号G01N35/10GK101151537SQ20068001049
公开日2008年3月26日 申请日期2006年3月30日 优先权日2005年3月30日
发明者此下龙, 绪方是嗣, 花房信博 申请人:株式会社岛津制作所;凸版印刷株式会社