专利名称：砀山酥梨果实石细胞含量主效qtl的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传育种领域，提供了 ‘砀山酥梨’果实石细胞含量主效QTL的分子标 记，可用于梨果实石细胞含量性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率，属于遗传育种领 域。背景技术：
梨(/yr皿L.)原产我国，是我国第三大果树树种。我国梨树分布广，种类、品种繁多， 其中‘砀山酥梨’是当前我国栽培面积最大的品种，栽培面积约400万亩。梨鲜果因其营养 价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。梨果实石细胞是影响其品质的重要因素之一，其作 为梨果实中所特有的组成成分，不仅影响到鲜食品质，而且影响到加工品质。因此，降低梨 果实石细胞的含量，对改善梨果品质至关重要。培育果实石细胞含量少的品种已经成为梨 育种的重要目标之一。由于梨为多年生果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易受环 境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应关系 难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基因作 为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子标 记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使 得数量性状基因座(QTL)定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能 性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标 记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通 过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分 离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助 选择(MAS)育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些 病害或生长性状，对重要品质性状梨石细胞的QTL定位及分子标记的研究尚没有开展。因 此，开展梨果实石细胞主效基因的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立杂交后代早期 辅助选择技术体系，对于提高梨果石细胞品质改良效率，缩短育种进程，节约生产成本显得 尤为重要。
发明内容
技术问题
本发明的目的是定位‘砀山酥梨’果实石细胞主效QTL，并提供与QTL位点紧密连锁的 分子标记，为实现对该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。技术方案
一种砀山酥梨果实石细胞含量主效QTL的分子标记，是通过下列步骤获得的
a)利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得F1代单株；
b)用梨基因组DNA，采用 SRAP 弓丨物 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3’ 和 fc3 5’ -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3’进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳 分离后，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其后代进行分析，并统计分析在亲本间具有多态性的 位点在后代群体中的遗传类型，将得到的多态性标记位点导入J0inmap3. 0作图软件，构建 ‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱；
l.c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’的F1群体单株的果实石细胞含量进行测定，利用 MapQTL5. 0作图软件的区间作图法，将F1群体每个单株的果实石细胞含量与‘砀山酥梨’遗 传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值彡2. 5为标准，大于2. 5说明存在 一个QTL位点，检测到在父本‘砀山酥梨’的第13连锁群DS13上检测到石细胞含量的QTL 位点Pcc2，其LOD值为3. 7，是主效QTL,距离最近的标记为fc3em4-195,大小为195bp,距 Pcc2的距离为0. 537cM,该标记即为梨果实石细胞含量的标记。所述QTL位点Pcc2位于 ‘砀山酥梨’第7连锁群上，其解释30. 7%的石细胞含量特征。所述分子标记可在梨分子育种中得到应用。其特征在于用梨基因组DNA，采用 SRAP 引物 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3’ 和 fc3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3，进行 PCR 扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得大小为I^bp的分子 标记，则标志该梨品种该梨品种梨果实石细胞含量主效QTL，果实含有较高的石细胞含量。
有益效果
(1)本发明首次对决定‘砀山酥梨’果实石细胞含量的数量性状位点进行了 QTL定位， 这为实现基于分子育种的多基因控制性状改良奠定了重要的基础和必要的前提。(2)本发明中确定了 ‘砀山酥梨’果实石细胞含量的QTL位点，对该数量性状决定 的贡献率较高，位点的贡献率为30. 7%。因此，基于此位点筛选连锁分子标记对目标性状判 断的准确性大大提高。(3)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需 (5cM,本发明中与主效QTL连锁的标记fC;3em4-195距离为0. 537cM,与目标位点表现为紧 密连锁，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。因此，以上标记具有 良好的应用价值，可加快对梨果实石细胞性状改良的进度
四
图1为‘砀山酥梨’的石细胞性状QTL定位。DS代表的是‘砀山酥梨’的连锁群，DS后的数字代表连锁群数。连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cM，右侧则表示的是分子标 记的名称。共有4种分子标记，“E-M-”为AFLP标记，E和M分别指限制性内切酶Eco I和 Mse I酶切，其后的数字是该标记多态性条带的编号；其它为SRAP和SSR标记。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间Pcc2。右边的曲线图为QTL的LOD 分布图，虚线为2. 5阈值。图2为SRAP引物组合fC;3em4-195在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。箭头所 指的条带即 fc!3em4-195，M 为 pBR322 DNA/ Msp I ladder。
五具体实施方式
实施例1 a)利用我国的两个梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交组合，获得其97株&群体。b)用 SSR (Simple sequence repeat)、 SRAP (Sequence related amplified polymorphism)禾口 AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子标记方法分 析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。利用SSR、SRAP、AFLP分子标记方法，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析， 并统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。SSR标记的实验操作程序参考 ^mamoto T.等(Euphytica，2002，1 1四_137)的 方法；SRAP标记的实验操作程序参考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 :455-461)的方 法；AFLP标记分别使用I和ifes I两种内切酶，具体实验操作程序参考Vos等(Nucleic Acids Res, 1995，23 :4407-4414)的方法。SSR和SRAP标记用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶强 碱银染法检测，AFLP标记用6%变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测。将SSR、、AFLP电泳图谱上清晰出现的多态性条带记为“ 1 ”，无带记为“0”，不清楚 的带或缺失记为“_”，根据已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)计算各多态性条带的 分子量。将分离条带按亲本来源归类，确定其来源及遗传类型。利用χ2测验分析各标记 分离是否符合3:1或1:1的孟德尔分离比例，偏分离的在标记末尾用“*”标注。最终获得 了 23个SSRs、S基因位点、2 个SRAPs和482个AFLPs等共732个多态性标记位点，然后 利用Ji0nmap3. O作图软件对其进行连锁分析，构建了一张包含216多态性标记的‘砀山酥 梨’梨遗传连锁图谱。SRAP 方法为
以梨DNA为模板，采用SRAP引物 em45' -GACTGCGTACGAATTTGA-3'
fc3 5，-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3，
扩增条件=SRAP分析的PCR扩增体系为总体积20ul 其中包含0. 2mmol · L-I dNTP， 0. 3ymol ‘ L-I 上下游引物，2. Ommol · L-I MgC12，1 个单位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng， IXBuffer。PCR 反应程序为94 °C 3min ;35 个循环94 °C 40s，55 °C 50s , 72 °C Imin ； 72 °C IOmin, 10 °C IOmin ；
扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。c)用Joinmap3. 0分析软件构建‘砀山酥梨’的分子遗传连锁图谱。将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap3. 0分析软件中适于cp群体构 图的格式导入J0inmap3. 0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，以L0D=4. 0 7.0，重组率=0.4，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图(Van Ooi jen，2001 )。d)在中国农业科学院郑州果树研究所试验地的栽培条件下，对八月红’ X ‘砀山 酥梨’F1群体的果实的石细胞含量进行了测定。测定方法采用冷冻法(聂继云，2006)。将石 细胞含量的表型值和‘砀山酥梨’连锁图谱的相关文件导入MapQTL5. 0作图软件，选择区间 作图法，以LOD值>2. 5为标准，对梨的石细胞含量在‘八月红’的连锁图谱上进行QTL分 析和定位。结果表明，在‘砀山酥梨’的第13连锁群(DS13)上检测到石细胞含量的QTL位 点Pcc2 (图1)，LOD值为3. 7，与最近的分子标记fc3em4-195的连锁距离为0. 537cM，对该 性状的贡献率为30. 7%。该QTL位点为主效QTL，其最近标记的距离也远小于可应用于分子 辅助选择的连锁标记与目标性状的所要求的最大距离。分子标记fC;3em4-195目标条带为
5195bp0实施例2
利用筛选到的与‘砀山酥梨’果实石细胞含量主效QTL相连锁的分子标记对‘八月红’ 与‘砀山酥梨’的97株F1杂交后代进行初步检测，以检测该方法在梨果实石细胞含量分子 标记辅助选择中的实用价值。用该97株后代的基因组DNA及SRAP弓丨物fc3和em4进行 PCR反应，电泳后根据fC;3em4-195条带的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在标记， 说明该植株的果实石细胞含量高，不存在则说明低，同时用实际测得的果实石细胞含量结 果与分子标记检测结果进行验证。结果显示，在‘八月红，和‘砀山酥梨，的97株F1杂交后代中，共有75株的DNA扩增 结果出现fC;3em4-195条带，这75株当中有49株的果实石细胞含量大于5 mg/g,所有这75 株的果实石细胞含量平均值为6. 5mg/g ；共有20株后代的DNA扩增结果不出现fc3em4-195 条带，其中11株的石细胞含量小于5 mg/g,所有这20株的果实石细胞含量的平均值为 5. lmg/g ； 2个单株条带缺失。用fC;3em4-195预测石细胞含量有较好的预测效果。
权利要求
1.砀山酥梨果实石细胞含量主效QTL的分子标记，是通过下列步骤获得的a)利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得F1代单株；b)用梨基因组DNA，采用 SRAP 弓丨物 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3’ 和 fc3 5’ -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3’进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳 分离后，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其后代进行分析，并统计分析在亲本间具有多态性的 位点在后代群体中的遗传类型，将得到的多态性标记位点导入J0inmap3. 0作图软件，构建 ‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱；c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’的&群体单株的果实石细胞含量进行测定，利用 MapQTL5. 0作图软件的区间作图法，将F1群体每个单株的果实石细胞含量与‘砀山酥梨’遗 传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值彡2. 5为标准，大于2. 5说明存在 一个QTL位点，检测到在父本‘砀山酥梨’的第13连锁群DS13上检测到石细胞含量的QTL 位点Pcc2，其LOD值为3. 7，是主效QTL,距离最近的标记为fc3em4-195,大小为195bp,距 Pcc2的距离为0. 537cM，该标记即为梨果实石细胞含量的标记。
2.根据权利要求1所述‘砀山酥梨’果实石细胞含量主效QTL的分子标记，其特征在 于所述QTL位点Pcc2位于‘砀山酥梨’第7连锁群上，其解释30. 7%的石细胞含量特征。
3.权利要求1或2所述分子标记在梨分子育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于用梨基因组DNA，采用SRAP引物em4 5，-GACTGCGTACGAATTTGA-3，和 fc3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3'进行 PCR 扩增，扩增产物 在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得大小为I^bp的分子标记，则标志该 梨品种该梨品种梨果实石细胞含量主效QTL，果实含有较高的石细胞含量。
全文摘要
本发明提供了砀山酥梨果实石细胞含量主效QTL的分子标记，属于遗传育种领域。利用SRAP、SSR、AFLP构建‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱，结合对果实石细胞含量的表型鉴定，采用区间作图法对此群体进行分析，在‘砀山酥梨’的第13连锁群上检测到主效QTL的存在，可解释30.7%的石细胞含量特征。距离主效QTL位点Pcc2最近的标记为fc3em4-195，其距离为0.537cM。所获得的石细胞主效QTL分子标记对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
文档编号C12N15/10GK102071194SQ20101055104
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者吴俊 , 吴华清, 张瑞萍, 张绍铃, 陶书田, 齐开杰 申请人:南京农业大学