用于检测与氯吡格雷药物抵抗反应相关的基因位点高效分型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种用于检测与氯化格雷药物抵抗反应相关 的基因位点高效分型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织报道，屯、脑血管疾病是世界范围内人口死亡的主要原因，我国目 前现有屯、梗、脑梗患者超过1000万，而且每年新增患者分别约100万、200万人。屯、肌梗死是 致死率最高的疾病，而卒中则是成人残疾的首位原因。
[0003] 抗血小板药物是目前屯、脑血管病预防和治疗的最主要的药物之一，是药物治疗中 的基础治疗。氯化格雷(药品名波立维）因其有效的降低屯、梗和卒中的发病风险和死亡率及 更好的安全性，是目前世界范围内最常使用的抗血小板药物。氯化格雷是一种新型嚷吩化 晚类衍生物。氯化格雷作为一种前药，需要在体内被代谢为活性形式才能够发挥其生物药 效活性。氯化格雷在小肠内被吸收后，受到ABCB1基因编码的质子累P糖蛋白调控，约有85% 被水解为无活性的簇酸，仅有15%会在肝脏中被细胞色素 P450家族的酶通过两步主要氧化 反应代谢为活性形式:首先在CYP2C19，CYP1A2和CYP2B6的催化下，氯化格雷的嚷吩环被打 开氧化为2-径基-氯化格雷；继而CYP3A4，CYP2B6，CYP2C19和CYP2C9继续将其催化为活 性产物，运种不稳定的活性形式在血小板上的ADP受体P2Y12经过肝脏时与之形成二硫键结 合，从而不可逆的抑制ADP激活血小板聚集。
[0004] 在长期的临床实践中发现患者对氯化格雷的反应性有很大的个体差异，并不是对 所有患者都有足够的保护作用，有相当一部分的患者会对氯化格雷产生低应答。近两年随 着药物基因组学的发展，发现除年龄、体指、血压、血脂、血糖等常规因素的影响外，基因多 态性是导致氯化格雷个体疗效差异性的主要原因，其中CYP2C19基因是导致氯化格雷疗效 下降的最主要代谢基因，其对临床事件的影响力超过上述传统因素的总和。氯化格雷代谢 不良可造成其抗血小板聚集作用明显降低，并且与患者屯、血管事件发生率增加直接相关。 2010年，美国食品和药物管理局(抑A)也发布公告，必须在氯化格雷(波立维)药品标签上注 明警告，建议用药前对患者进行基因检测，经基因检测证实的因 CYP2C19基因多态性造成细 胞色素酶(CYP)功能异常者，或其他药物影响CYP2C19活性者，应改变氯化格雷的服用剂量 或者使用其他抗血小板药。近年来在中国人群中也已经有很多研究发现携带有CYP2C19功 能缺失基因 CYP2C19*2(rs4244285,681G>A)和 CYP2C19*3(rs4986893,636G>A)都会使病人 在进行氯化格雷抗血小板治疗的时候出现高血小板活性状态，导致氯化格雷的无应答或者 低应答，并且携带功能缺失突变的病人服用氯化格雷进行抗血小板治疗后更易发生屯、脑血 管缺血事件。在亚洲南部人群中CYP2C19巧和CYP2C19*3的发生概率明显高于美国、欧洲、亚 洲东部等人群。因此在临床用药过程中，应首先对患者进行CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因 分型检测，若有一个或两个基因位点变异，则应改变氯化格雷的服用剂量或者使用其他抗 血小板药。用药前进行基因分型检测对于临床指导个体化合理安全用药有重要意义。
[0005] 本发明提供了一种简便、精确地检测CYP2C19*2(rs4244285^PCYP2C19*3 (rs4986893)基因位点的试剂盒，为个体化抗血小板治疗提供依据。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于检测与氯化格雷药物抵抗反应相关的基因位点 高效分型的试剂盒。
[0007] 本发明提供的用于检测与氯化格雷药物抵抗反应相关的基因位点高效分型的试 剂盒是基于Sequenom MassARRAY分型系统，包含用于扩增位点CYP2C19*2(rs4244285)和 CYP2C19*3(rs4986893)的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
[000引所述基因位点CYP2C19*2(rs4244285)的PCR扩增引物序列如SEQ ID N0.1-2 所示;CYP2C19*3(rs4986893)的PCR扩增引物序列如SEQ ID N0.3-4所示。所述基因位点 CYP2C19*2(rs4244285)的单碱基延伸引物序列如SEQ ID N0.5所示；CYP2C19*3 (rs4986893)的单碱基延伸引物序列如SEQ ID N0.6所示。上述引物序列见表1。
[0009] 所述试剂盒还包括PCR混合缓冲液(PCR Buffer Mix);MgCl2;dNTP;PCR酶(PCR Enzyme);SAP混合缓冲液（SAP Buffer Mix);SAP酶（SAP Enzyme);iPlex Termination;延 伸酶（iPlex Enzyme)和延伸混合缓冲液（iPlex Buffer Mix)。
[0010] 本试剂盒所述的PCR扩增引物和PCR延伸引物在同一孔内与样本DNA发生反应， 同时检测两个位点并判断其突变情况。
[0011] 本试剂盒基于Sequenom MassArray高通量基因分型系统，对已发现的氯化格雷药 物抵抗基因位点设计了特异性PCR引物和延伸引物，可W在同一孔实现2个抵抗基因位点的 检测。本发明具有简便、高效和精准的优点。用于在受试者服用氯化格雷之前，通过检测受 试者的基因位点是否有变异，指导受试者个体化合理用药，可W为个体化抗血小板治疗提 供依据。
【附图说明】
[0012] 图 1 为Sequenom MassArray忍片扫描CYP2C19*2(rs4244285)的分型图。
[0013] 图2为Sequenom MassArray忍片扫描CYP2C19*3(rs4986893)的分型图。
【具体实施方式】 实施例
[0014] 1.参照生产厂家的说明书提取受试者的全血、唾液或其他组织的基因组DNA。
[0015] 2.主要试剂:用于检测与氯化格雷药物抵抗反应相关的基因位点高效分型的检测 试剂盒试剂。主要成分包括PCR混合缓冲液(PCR Buffer Mix);MgCl2;dNTP;PCR酶（PCR Enzyme);SAP混合缓冲液（SAP Buffer Mix);SAP酶（SAP Enzyme);iPlex Termination;延 伸酶（iPlex Enzyme)和延伸混合缓冲液（iPlex Buffer Mix)。
[0016] 3. PCR扩增反应体系及PCR程序 PCR体系：
4. PCR产物碱性憐酸化处理 在PCR结束后，将PCR产物用SAP酶处理，SAP酶消化未结合的dNTP。
[0017] SAP 体系：
SAP PCR程序:37°C 40分钟，85°C 5分钟，最后4°C恒溫。
[0018] 5.单碱基延伸反应体系及PCR程序 单碱基延伸反应体系：
单碱基延伸PCR程序：
6.树脂纯化，忍片扫描，使用1日3341^日乃79日'4.0软件对原始结果进行分析后并输出 结果。
[0019] 结果举例:见附图1-2。
[0020] 图 1 为Sequenom MassArray忍片扫描CYP2C19*2(rs4244285)的分型图。768 个个 体在CYP2C19巧(rs4244285)位点成功分型聚类，其中347个体为纯合子GG，91个体为纯合 子AA，315个体为杂合子AG。
[0021] 图2为Sequenom MassArray忍片扫描CYP2C19*3(rs4986893)的分型图。768 个个 体在CYP2C19*3(rs4986893)位点成功分型聚类，其中690个体为纯合子GG，1个体为纯合 子AA，68个体为杂合子AG。
[0022] 表1. CYP2C19*2(rs4244285)和CYP2C19*3(rs4986893)的PCR扩增引物和单碱基 延伸引物
[0023] 序列表 沈Q ID N0.1: ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC 沈Q ID N0.2: ACGTTGGATGCACTTTCCATAAAAGCAAGG 沈Q ID N0.3: ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC 沈Q ID N0.4: ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG 沈Q ID N0.5: TCCCACTATCATTGATTATTTCCC 沈Q ID N0.6: ATTGTAAGCACCCCCTG。
【主权项】
1. 一种用于检测与氯吡格雷药物抵抗反应相关的基因位点高效分型的试剂盒，其特征 在于：该试剂盒是基于Sequenom MassARRAY分型系统，包含用于扩增位点CYP2C19*2 (rs4244285)和CYP2C19*3(rs4986893)的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述基因位点CYP2C19*2(rs4244285) 的PCR 扩增引物序列如SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2 所示；CYP2C19*3(rs4986893)的PCR 扩增引物序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；所述基因位点CYP2C19*2(rs4244285) 的单碱基延伸引物序列如SEQ ID N0.5所示;CYP2C19*3(rs4986893)的单碱基延伸引物序 列如SEQ ID NO.6所示。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR混合缓冲液;MgCl2; dNTP;PCR酶;SAP混合缓冲液;SAP酶；iPlex Termination;延伸酶和延伸混合缓冲液。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于： PCR扩增反应体系为：SAP体系为：单碱基延伸反应体系为：
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体为用于检测与氯吡格雷药物抵抗反应相关的基因位点高效分型的试剂盒。本发明试剂盒是基于Sequenom？MassARRAY分型系统，包含基因位点<i>CYP2C19</i>*2(rs4244285)和<i>CYP2C19</i>*3(rs4986893)的PCR扩增引物和单碱基延伸引物；其中，基因位点的PCR？扩增引物序列分别如SEQ？ID？NO.1、SEQ？ID？NO.2？以及？SEQ？ID？NO.3？、SEQ？ID？NO.4？所示；所述基因位点的单碱基延伸引物序列分别如SEQ？ID？NO.5？和？SEQ？ID？NO.6？所示。在受试者服用氯吡格雷之前，通过检测受试者的基因位点是否有变异，指导受试者个体化合理用药，为个体化抗血小板治疗提供依据。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105671165
【申请号】CN201610123251
【发明人】徐剑锋, 刘旭
【申请人】复旦大学附属华山医院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月5日