定量检测胶质瘤中herc2p2表达量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸的测定和检测方法领域，具体是一种定量检测胶质瘤中皿RC2P2 表达量的方法。
【背景技术】
[0002] 长链非编码RNA (long non-coding RNA, Inc RNA)是近年来发现的RNA家族重 要成员，是指长度在200ntW上，并且不编码蛋白的RNA。最初，运些非编码的转录本被认为 是"暗物质'或"噪音"。近年来，随着RNA研究技术和水平的不断提高，人们发现非编码RNA在 生物体中发挥着十分重要的功能。Lnc RNA能够参与免疫系统的调控，X染色体的沉默，蛋白 质功能的调控等一系列生理功能。近期发现，皿RC2P2也是一个IncRNA，位于15号染色体 上，是肥RC2的假基因，共有6075个碱基，其与肿瘤的关系也十分密切。所W定量测定 肥RC2P2的表达量对肿瘤的预防和治疗具有重要的临床意义。 化qman探针法是高度特异性的定量PCR技术。其核屯、是利用化q酶的3 ' -5 '外切酶活性， 切断探针，产生巧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所W巧光信号的强弱就代表了模 板的数量。
[0003] 在化qman探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与 模板特异性结合，其结合位点在两条引物之前。探针的5'端标记有报告基团（Reporter，!?）， 如FAM，VIC等，3 '端标记有巧光泽灭基团（Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报 告基团所发射的巧光能量被泽灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taqman酶 在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3 ' -5 '外切核酸酶活性就会将探针切断，报告 基因远离泽灭基团，其能量不能被吸收，及产生巧光信号。所W，每经过一个PCR循环，巧光 信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号强度就代表了模板DNA的拷贝 数。
[0004] 普通的SYBR Green Real Time PCR，巧光染料非特异性的结合在双链DNA上，容易 受到非特异性扩增和引物二聚体的影响，而化qman探针法能够显著提高PCR检测的灵敏性 和准确度。并且还能够利用多种巧光同时进行多重分析，运也是普通SYBR等DNA结合巧光基 团所不具备的。
【发明内容】
[0005] 本发明就是为了填补定量检测皿RC2P2表达量方法领域的空白，所提出的一种定 量检测胶质瘤中肥RC2P2表达量的方法。
[0006] 本发明是按照W下技术方案实现的。
[0007] -种用于定量检测胶质瘤中皿RC2P2表达量的探针和引物，上游引物的核酸序列 如Seq ID N0.1所示；下游引物的核酸序列如Seq ID ^.2所示；了曰9111曰]1探针核酸序列如 SeqIDN0.3所示。
[000引一种应用上述的探针和引物定量检测胶质瘤中皿RC2P2表达量的方法，包括W下 步骤： a. 检测样本RNA的提取； b. 将步骤a中获得RNA逆转录为cDNA; C.W步骤b中获得的cDNA为模板，应用权利要求1所述的引物和探针，进行巧光定量 PCR，测定样本中肥RC2P2表达量。
[0009] 本发明获得了如下的有益效果。
[0010] 本发明有效的填补定量检测皿RC2P2表达量方法领域的空白，能够快速、精确、有 效的检测胶质瘤中肥RC2P2表达量，对临床胶质瘤病人级别和生存期预测具有指导意义。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明化qman探针PCR过程图； 图2是本发明肥RC2P2的表达量与胶质瘤级别之间的关系图； 图3是本发明肥RC2P2的表达量与病人存活率之间的关系图。
【具体实施方式】
[0012] 1.肥RC2P2基因的核巧酸序列化ene ID: 400322)
ataattacac ccatt 6075 2.实验方法与结果 2.1检测样本RNA的提取 取小块临床样本，加入1ml Trizol，超声波匀浆破碎仪（美国声能学公司（Sonics)， CV18)研磨。再加入0.2ml Ξ氯甲烧，摇匀后4°C 13000巧m离屯、15min，小屯、取上层水相， 转移至干净的离屯、管中，加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀过夜。4°C 130(K)rpm离屯、lOmin， 离屯、管底部少量胶状沉淀为RNA。弃去上清，用1ml 75%的乙醇震荡清洗RNA沉淀，4°C 13000巧m离屯、lOmin。弃去上清，1ml无水乙醇震荡清洗RNA沉淀，4°C 13000巧m离屯、 lOmin。弃去上清，室溫干燥5-lOmin，dd出0溶解。
[0013] 2.2 RNA逆转录为cDNA(普洛麦格公司，A5000) 反应体系为:RNA模板lug;01igo肌lul;出0 lOul; 65°C加热5min，W打开二级结构，冰上冷却； 继续在反应体系中加入5X反应缓冲液4ul;RNA酶抑制剂lul;dNTP化1;逆转录酶 lul ； 42 °C反应1小时，70°C加热5min，终止反应，得到胶质瘤临床样本cDNA。
[0014] 2.3引物和探针的设计 根据NCBI上皿RC2P2序列，设计化qman PCR引物及探针。根据引物设计原则，上下游引 物长度在15至30个碱基之间，GC含量在40%至60%，Tm值之间的差异在rC W内，上下游引物 之间无互补序列，且Real Time PCR序列的长度在300碱基W下。
[0015] 具体序列为： 肥 RC2P2 上游引物:GGCAGCACCTCCTACAG 肥 RC2P2 下游引物：CCTTTCAGTTTGGGCTTCAG 化qman探针一般设计原则为，探针位置尽可能地靠近上游引物;探针长度通常在25- 35个碱基，Tm值在65-70°C，通常比引物Tm高5-10°C，GC含量在40%-70%。探针的5'端应避免 使用碱基G。整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
[0016] 肥RC2P2探针：CGTCCTCTGTGTCCGAATCCTCCTCTGCTG 内参基因为GAPDH，其引物序列和换针序列为： GAPDH 上游引物：CCAACGTGTCAGTGGTGGAC GAPDH下游引物:TAGCCCAGGATGCCCTTGAG GAPDH 探针：TCCGACGCTGCTTCACCACCTCT 2.4巧光定量PCR测定样本中肥RC2P2表达量(普洛麦格公司，A6001) 取lul胶质瘤样本cDNA，稀释至lOul，作为化qman探针PCR的模板。具体化qman探针 PCR的反应体系为： 稀释后的cDNA板板 2ul 上游引物 lul 下游引物 lul Taqman 探针 lul Taqman mix lOul 出0 加1 PCR扩增程序为：95°C预变性10min:95°C变性20 s;58°C退火及延伸Imin;共40个循 环。
[0017]2.5临床试验 2.5.1肥RC2P2的表达量与胶质瘤级别之间的关系 用本发明所述方法在29例胶质瘤临床样本的cDNA中检测肥RC2P2的表达，将编号为 1111的II级胶质瘤病人cDNA HERC2P2相对含量定义为1，得到其他胶质瘤病人cDNA 肥RC2P2的表达量，实验结果如图1、图2和表1所示。
[0018] 实验结果表明，其中II级14例，III级5例，IV级10例，肥RC2P2的表达量与 胶质瘤的级别负相关，其中II级与IV的表达量具有显著性差异，P=〇.0318。
[0019] 1.5.2肥RC2P2的表达量与病人存活率之间的关系 用本发明所述方法在158例胶质瘤样本中检测肥RC2P2的表达量，对肥RC2P2高表达和 低表达与病人生存率之间的关系进行分析(结果如图3所示）。实验结果表明，肥RC2P2的表 达量与病人生存率成正相关。
[0020] 沈卵ENCE LISTING <110〉天津医科大学总医院 <120〉定量检测胶质瘤中肥RC2P2表达量的方法 <130〉 1 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 17 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥RC2P2上游引物 <222〉 （1)..(17) <400〉 1 ggcagcacct cctacag 17 <130〉 2 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 20 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥RC2P2下游引物 <222> (1)..(20) <400〉 1 cctttcagtt tgggcttcag 20 <130〉 3 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 30 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥RC2P2 探针 <222〉 （1)..(30) <400〉 1 cgtcctctgt gtccgaatcc tcctctgctg 30 <130〉 4 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 6075 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥 RC2P2 基因 <222〉 (1)..(6075) <400〉 1 tc邑邑ccc邑cc cctc邑邑邑cc邑c邑曰邑曰邑邑c邑c c邑邑邑曰tc邑c邑邑邑c邑cc邑邑ct邑曰邑cc曰邑egg 60
【主权项】
1. 一种用于定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的探针和引物，其特征在于:上游引物的 核酸序列如Seq ID N0.1所示;下游引物的核酸序列如Seq ID勵.2所示汀&9111&11探针核酸 序列如Seq ID NO.3所示。2. -种应用权利要求1所述的探针和引物定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的方法，其 特征在于:包括以下步骤： a. 检测样本RNA的提取； b. 将步骤a中获得RNA逆转录为cDNA; c. 以步骤b中获得的cDNA为模板，应用权利要求1所述的引物和探针，进行荧光定量 PCR，测定样本中HERC2P2表达量。3. 根据权利要求2所述的定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的方法，其特征在于:所述 步骤a中提取样本RNA的步骤为:取小块样本，加入Tr i zo 1溶液并研磨;按照体积比为Trizol 溶液:三氯甲烷=5:1的比例加入三氯甲烷，2-8°C，12000-13000rpm离心12-18 min;取上层 水相加入等体积的异丙醇，2-8°C，12000-13000rpm离心10min;弃上清，先后用与Trizol溶 液等体积的75%乙醇和无水乙醇洗涤沉淀，干燥，用ddH 20溶解沉淀。4. 根据权利要求2所述的定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的方法，其特征在于:所述 步骤b中RNA逆转录为cDNA的步骤为：取步骤a中获得的RNA模板lug;01igo dT lul;H20 10ul，60-70°C保温5min，冰上冷却;再向上述混合液中加入5 X反应缓冲液4ul ;RNA酶抑 制剂 lul;dNTP 2ul;逆转录酶 lul，40-42°C保温lh，70°C保温5-15 min。5. 根据权利要求2所述的定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的方法，其特征在于:所述 步骤c中荧光定量PCR的扩增体系为：稀释后的步骤b中获得的cDNA模板2ul;上游引物 lul;下游引物 lul;Taqman探针 lul;Taqman mix 10ul;H2〇 5ul。6. 根据权利要求2所述的定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的方法，其特征在于:所述 步骤c中荧光定量PCR的扩增程序为:95°C 10min;95°C 20s;58°C lmin;40个循环。
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测胶质瘤中HERC2P2表达量的方法，包括以下步骤：a.检测样本RNA的提取；b.将步骤a中获得RNA逆转录为cDNA；c．以步骤b中获得的cDNA为模板，应用上、下游引物和探针，进行荧光定量PCR，测定样本中HERC2P2表达量。所述上游引物的核酸序列如Seq？ID？NO.1所示；下游引物的核酸序列如？Seq？ID？NO.2所示；Taqman探针核酸序列如Seq？ID？NO.3所示。本发明有效的填补定量检测HERC2P2表达量方法领域的空白，能够快速、精确、有效的检测胶质瘤中HERC2P2表达量，对临床胶质瘤病人级别和生存期预测具有指导意义。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671162
【申请号】CN201610119988
【发明人】康春生, 王琦雪, 韩磊, 周俊虎
【申请人】天津医科大学总医院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月3日