微胶囊组合物及方法
【专利说明】微胶囊组合物及方法 夺叉引用
[0001] 本申请要求2012年8月14日提交的美国临时专利申请号61/683, 192、2012年12 月14日提交的美国临时专利申请号61/737,374、2013年2月8日提交的美国临时专利申 请号61/762,435、2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/800, 223、2013年6月 27日提交的美国临时专利申请号61/840,403和2013年7月10日提交的美国临时专利申 请号 61/844, 804的权益，所述临时专利申请为所有目的在此通过引用整体并入本文。 发明背景
[0002] 分析物的检测和量化对于分子生物学和医学应用如诊断至关重要。遗传检测对于 许多诊断方法特别有用。例如，用DNA序列信息可以检测或更准确地表征由突变引起的病 症如癌症。
[0003] 在进行分子反应如测序反应之前，常常需要适当的样品制备。起始样品可以是生 物样品，诸如细胞、组织或核酸的集合。当起始材料是细胞或组织时，样品可能需要裂解或 以其它方式进行操作，以允许分子如DNA的提取。样品制备还可以包括对分子进行片段化、 分离分子和/或将独特标识符（identifier)附接至分子的特定片段，以及其它操作。本领 域中存在对用于在下游应用之前制备样品的改进方法和装置的需要。
【发明内容】
[0004] 本公开内容提供了用于微胶囊阵列装置的组合物和方法。
[0005] 本公开内容的一个方面提供了包含第一微胶囊的组合物，其中：当向第一微胶囊 施加刺激时，第一微胶囊是可降解的；并且第一微胶囊包含寡核苷酸条形码。在一些情况 下，第一微胶囊可包含化学交联体。该化学交联体例如可以是二硫键。在一些情况下，该组 合物可包含聚合物凝胶，例如，聚丙烯酰胺凝胶。第一微胶囊可包含珠粒。在一些情况下， 该珠粒可以是凝胶珠粒。
[0006] 此外，所述刺激可以选自生物刺激、化学刺激、热刺激、电刺激、磁刺激或光刺激及 其组合。在一些情况下，化学刺激可以选自pH的变化、离子浓度的变化和还原剂。该还原 剂可以是，例如，二硫苏糖醇OTT)或三（2-羧乙基）膦（TCEP)。
[0007] 第二微胶囊可包含第一微胶囊。而且，第二微胶囊可以是微滴。在一些情况下，该 组合物还可以包含含有寡核苷酸条形码的核酸，其中该核酸包含脱氧尿苷三磷酸（dUTP)。 在一些情况下，该组合物可包含不能接受脱氧尿苷三磷酸（dUTP)的聚合酶。而且，该组合 物可包含靶分析物，例如核酸。该核酸可以选自〇嫩、1?嫩、(1阶1\(1(1阶1\扩增子、合成核苷酸、 合成多核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸、cDNA、dsDNA、ssDNA、质粒DNA、粘粒DNA、高分 子量（丽)DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、 tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核糖开关（riboswitch) 和病毒RNA。在一些情况下，该核酸可以是基因组DNA(gDNA)。
[0008] 此外，寡核苷酸条形码的密度可以是至少约1，〇〇〇, 000个寡核苷酸条形码/第一 胶囊。该寡核苷酸条形码可以通过化学交联体（例如二硫键）偶联至微胶囊。
[0009] 本公开内容的另一方面包括包含多个分区（partitions)的装置，其中：所述多个 分区中的至少一个分区包含含有寡核苷酸条形码的微胶囊；并且当向微胶囊施加刺激时， 该微胶囊是可降解的。该分区例如可以是孔（well)或微滴。在一些情况下，微胶囊包含化 学交联体，例如二硫键。而且，该微胶囊可包含聚合物凝胶，例如聚丙烯酰胺凝胶。另外，该 微胶囊可以包含珠粒。在一些情况下，该珠粒可以是凝胶珠粒。
[0010] 所述刺激可以选自生物刺激、化学刺激、热刺激、电刺激、磁刺激或光刺激及其组 合。在一些情况下，化学刺激可以选自pH的变化、离子浓度的变化和还原剂。该还原剂例 如可以是二硫苏糖醇0TT)或三（2-羧乙基）膦（TCEP)。
[0011] 此外，核酸可以包含寡核苷酸条形码且该核酸可包含脱氧尿苷三磷酸（dUTP)。在 一些情况下，所述分区可以包含不能接受脱氧尿苷三磷酸（dUTP)的聚合酶。另外，该分区 可以包含靶分析物，例如核酸。该核酸可以选自DNA、RNA、dNTP、ddNTP、扩增子、合成核苷 酸、合成多核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸、cDNA、dsDNA、ssDNA、质粒DNA、粘粒DNA、高 分子量（MW)DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、 rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核糖开关和病毒 RNA。在一些情况下，该核酸可以是基因组DNA(gDNA)。该寡核苷酸条形码可以通过化学交 联体偶联至微胶囊。在一些情况下，该化学交联体可以是二硫键。
[0012] 本公开内容的又一方面提供了用于样品制备的方法，该方法包括将包含寡核苷酸 条形码和靶分析物的微胶囊合并至分区中，其中当向微胶囊施加刺激时，该微胶囊是可降 解的；以及向微胶囊施加刺激，以将寡核苷酸条形码释放至靶分析物。该分区可以是，例如， 孔或微滴。在一些情况下，微胶囊可包含聚合物凝胶，例如聚丙烯酰胺。另外，该微胶囊可 包含珠粒。在一些情况下，该珠粒可以是凝胶珠粒。此外，该微胶囊可包含化学交联体，例 如二硫键。
[0013] 所述刺激可以选自生物刺激、化学刺激、热刺激、电刺激、磁刺激或光刺激及其组 合。在一些情况下，该化学刺激可以选自pH的变化、离子浓度的变化和还原剂。该还原剂 可以是，例如，二硫苏糖醇0TT)或三（2-羧乙基）膦（TCEP)。
[0014] 此外，核酸可以包含寡核苷酸条形码且该核酸可包含脱氧尿苷三磷酸（dUTP)。在 一些情况下，所述分区可以包含不能接受脱氧尿苷三磷酸（dUTP)的聚合酶。而且，该方法 还可以包括将寡核苷酸条形码附接至靶分析物。该附接可以通过例如核酸扩增反应来完 成。此外，分析物可以是核酸。在一些情况下，该核酸可以选自〇嫩、1?嫩、(1阶1\(1(1阶1\扩增 子、合成核苷酸、合成多核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸、〇0嫩、(1如嫩、％0嫩、质粒0嫩、 粘粒DNA、高分子量（MW) DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA (线粒体 DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核糖 开关和病毒RNA。在一些情况下，该核酸可以是基因组DNA(gDNA)。而且，寡核苷酸条形码 可通过化学交联体偶联至微胶囊。在一些情况下，该化学交联体可以是二硫键。
[0015] 本公开内容的又一方面提供了包含可降解凝胶珠粒的组合物，其中该凝胶珠粒包 含至少约1，〇〇〇, 〇〇〇个寡核苷酸条形码。在一些情况下，这1，〇〇〇, 〇〇〇个寡核苷酸条形码 是相同的。 援引并入
[0016] 在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均为所有目的通过引用而全文 并入本文，且其程度等同于具体地和单独地指出各个单独的出版物、专利或专利申请通过 引用并入本文。
【附图说明】
[0017] 本公开内容的装置的新颖特征在所附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对其 中利用了本发明装置的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本 公开内容的特征和优点的更好理解，附图中：
[0018] 图1A是微胶囊或内部试剂微滴的示意图。
[0019] 图1B是包含多个内部试剂微滴的微胶囊的示意图。
[0020] 图2A是示例性微胶囊阵列的俯视图的图示。
[0021] 图2B是微胶囊阵列的示例性侧视图的图示。
[0022] 图3是在96孔板支持物上的多微胶囊阵列配置的示意图。
[0023] 图4A是在微孔胶囊阵列的一个微孔中的反应顺序的示意流程图。
[0024] 图4B类似于图4A，不同之处在于其中注释有可以在每个步骤中进行的方法的实 例。 发明详沭
[0025] 虽然本文已显示并描述了本发明的多种实施方案，但是对本领域技术人员来说显 而易见的是，这些实施方案仅作为实例来提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下 可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代 方案。 I.总体概述
[0026] 本公开内容提供了微孔或其它分区胶囊阵列装置以及使用这类装置的方法。通 常，该装置是分区（例如，微孔，微滴）的组装体，该分区加载有微胶囊，通常以特定的微胶 囊/分区的浓度加载。
[0027] 所述装置可特别适用于执行样品制备操作。在一些情况下，装置将样品（例如，核 酸的不均匀混合物，细胞的混合物，等等）细分成多个分区，使得仅样品的一部分存在于各 个分区中。例如，可以对包含核酸混合物的核酸样品进行分割（partition)，使得在各个分 区中存在不超过核酸的一条链（或一个分子）。在其它实例中，可以对细胞样品进行分割， 使得在各个分区中存在不超过一个细胞。
[0028] 分割步骤之后，可以在装置内对细分的样品进行许多不同操作中的任何操作。分 区可以包含含有一种或多种试剂（例如，酶、独特标识符（例如，条形码）、抗体等）的一个 或多个胶囊。在一些情况下，所述装置、配套装置或用户提供触发（trigger)，该触发使微 胶囊将一种或多种试剂释放至相应的分区中。试剂的释放可以使试剂能够与细分的样品接 触。例如，如果该试剂是独特标识符，例如条形码，则该样品可以用独特标识符标记。标记 后的样品随后可以用于下游应用，如测序反应。
[0029] 在本文公开的装置内可进行多种不同的反应和/或操作，包括但不限于：样品分 害J、样品分离、结合反应、片段化（例如，在分割之前或分割之后）、连接反应和其它酶反应。 该装置还可以用于多种不同的分子生物学应用，包括但不限于：核酸测序、蛋白质测 序、核酸量化、测序优化、检测基因表达、量化基因表达以及基因组标记物或表达的标记物 的单细胞分析。此外，该装置具有许多医学应用。例如，它可用于包括癌症在内的多种遗传 性和非遗传性疾病和病症的鉴定、检测、诊断、治疗、分期或风险预测。 II.微胶囊
[0030] 图1A是示例性微胶囊的示意图，该微胶囊包含被第二层130包封的内部隔室120， 第二层130被固体的或半渗透性的壳或膜110封装。通常，该壳将内部隔室与它们的直接 环境（例如，微孔的内部）隔开。内部隔室，例如120、130,可包含材料，例如试剂。如图1A 所示，试剂100可以存在于内部隔室120中。然而，在一些情况下，试剂位于包封层130中 或位于这两个隔室中。通常，在引入特定触发之后，微胶囊可以释放内部材料或其一部分。 该触发可导致壳层110和/或内部包封层130的破坏，从而使内部隔室100、120与外部环 境如微孔的空腔接触。
[0031] 该微胶囊可包含若干流体相并且可以包含乳液（例如，油包水乳液、水包油乳 液）。微胶囊可包含与包封内层的第二层130不混溶的内层120。例如，内层120可以包含 水性流体，而包封层130可以是非水性流体，如油。相反地，内层120可以包含非水性流体 (例如，油）而包封层130可以包含水性流体。在一些情况下，微胶囊不包含第二包封层。 通常，微胶囊被壳层110进一步封装，壳层110可以包含聚合物材料。在一些情况下，微胶 囊可包含微滴。在一些情况下，微胶囊可以是微滴。
[0032] 微滴和微滴生成方法例如在第RE41，780号美国专利中描述，该专利为所有目的 通过引用而全文并入本文。该装置还可以包含微流体元件，该微流体元件能够使样品和/ 或微胶囊穿过该装置流动并使样品和/或微胶囊在分区内分布。
[0033] 该微胶囊可包含多个隔室。该微胶囊可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000 或 50000 个隔室。在其它 情况下，该微胶囊包含少于 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、 500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、 8000、8500、9000、9500、10000或50000个隔室。类似地，各个隔室或其子集也可以细分成 多个额外的隔室。在一些情况下，各个隔室或其子集细分成至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、 4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000或50000个隔室。在 其它情况下，各个隔室或者其子集进一步细分成少于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000 或 50000 个隔室。
[0034] 在多个隔室中存在试剂的多种可能的分布。例如，各个隔室（或隔室总数的某 一百分比）可包含相同的试剂或相同的试剂组合。在一些情况下，各个隔室（或隔室总数 的某一百分比）包含不同的试剂或不同的试剂组合。
[0035] 隔室可以以多种方式配置。在一些情况下，微胶囊可包含通常被不混溶层隔开的 多个同心隔室（包含前面的隔室的隔室的重复单元）。在这样的微胶囊中，试剂可以存在于 交替的隔室中、每第三个隔室中或每第四个隔室中。
[0036] 在一些情况下，大多数具有微胶囊的隔室不是同心的；相反，它们在微胶囊内作为 单独的、自包含的实体存在。图1B示出了包含多个较小微胶囊140的微胶囊的实例，各个 较小微胶囊140包含试剂。如同本文所述的许多其它微胶囊，微胶囊可以被外壳封装，该外 壳通常包含聚合物材料150。在较大的微胶囊内封装的多个较小微胶囊可以被不混溶流体 160在物理上分隔，从而在施加刺激并将试剂释放至溶液中之前防止试剂的混合。在一些 情况下，该不混溶流体加载有额外的材料或试剂。在一些情况下，多个较小微胶囊被一层不 混溶流体（例如，170)包围，该不混溶流体层进一步被与微胶囊的内部流体混溶的流体160 包围。例如，内部微胶囊180可包含被不混溶（例如，油）层包封的水性内部，该不混溶层 进一步被水性层160包围。可混溶隔室（例如，160和180)可各自包含试剂。