Rhg1介导的对大豆胞囊线虫的抗性的制作方法
【专利说明】RHG1介导的对大豆胞囊线虫的抗性
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月11日提交的美国临时专利申请61/646, 017、2012年7月 27日提交的美国临时专利申请61/676, 854、以及2013年3月15日提交的美国实用新型申 请13/843, 447的优先权，以上专利以其整体引用并入本文。
[0003] 关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明是在由USDA/NIFA授予的资助号06-CRHF-0-6055和10-CRHF-0-6055的政 府支持下完成。政府对本发明具有一定的权利。
[0005] 序列表
[0006] 本申请附有附序列表，其以整体并入本文。序列表以text文件与本申请一起在 2013年5月13日提交。
【背景技术】
[0007] 大豆胞囊线虫（SCN)目前是在大多数年份对美国大豆产量造成经济损坏最严重 的疾病。估算表明，每年在美国SCN导致超过7亿美元的大豆产量减少。在其它国家，如巴 西，阿根廷和中国，SCN也严重影响大豆产量。已经鉴定出具有增加的SCN抗性的大豆品种， 但抗性是定量的并且其功效取决于线虫基因型，因此使用具有更强抗性的品种仍可能导致 由SCN造成的大豆产量损失。
[0008] 对SCN抗性的遗传基础已经被部分定义至遗传基因座水平，大豆基因座Rhgl的合 适来源对SCN抗性有实质性贡献。在本工作之前，控制Rhgl介导的SCN抗性的特异基因和 基因产物尚未得到成功记录。
【发明内容】
[0009] 在本文中提供增加植物对线虫抗性，特别是增加大豆对SCN抗性的方法。鉴定了 来自rhgl-b基因座的若干基因产物，并证明了在大豆中所述基因产物与SCN抗性的关系。 这些基因和基因产物也可以增加其他植物的抗性，包括但不限于，糖甜菜、土豆、玉米、豌 豆、或菜豆（bean)对于线虫，特别是胞囊线虫的抗性。
[0010] 在一个方面中，本发明提供通过增加多核苷酸的表达、或改变多核苷酸的表达模 式或增加多核苷酸的拷贝数增加植物对线虫（合适地胞囊形成线虫、合适地SCN)抗性的 方法，所述多核苷酸在所述植物的细胞中编码Glymal8g02580多肽、Glymal8g02590多肽、 Glymal8g02610 多肽、与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 或SEQID N0:3具有90%或更多同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能变体。本发明还涉及 所述多肽的组合的用途。编码这些多肽序列的多核苷酸可源自Williams82、PI88788或 Peking(PI548402)大豆品种或所述多核苷酸的其它来源。提供所述多肽序列，并注意到在 不同品种中序列之间的多态性。在植物细胞中增加的多核苷酸表达增加了植物对线虫的抗 性。合适地，在植物根细胞中增加表达。合适地，增加所述多核苷酸中的至少两个的表达。 合适地，增加多核苷酸中的全部三个的表达。
[0011] 在另一个方面，本发明提供通过改变（增加或减少）植物根细胞中多肽的表达增 加植物对线虫（合适地胞囊形成线虫、合适地SCN)抗性的方法，所述多肽与Glymal8g02580 的5￡〇10吣：1、61711^18§02590 的5￡〇10吣：2、5或6或61711^18§02610 的5￡〇10吣：3 的至少一部分相同或相似，所述改变是相对于在植物根细胞中其表达被用作对照的多肽 (如，Glymallg35820)表达来进行。合适地，增加所述多肽中的至少两个的表达。合适 地，增加所述多肽中的全部三个表达。可选择地或此外，也可增加编码Glymal8g02610、 Glymal8g02590和/或Glymal8g02580多肽的多核苷酸表达。
[0012] 在另一个方面，本发明提供通过鉴定在植物根细胞中显示改变的（增加或减少） 多肽表达的植物鉴定显示有用水平的对线虫（合适地胞囊形成线虫，合适地SCN)抗性的植 物的方法，所述多肽与61711^18§02580的5￡〇10勵：1、61711^18§02590 的5￡〇10勵:2、5 或6或Glymal8g02610的SEQIDN0:3的至少一部分相同或相似，所述改变是相对于在植 物根细胞中其表达被用作对照的多肽（例如，Glymallg35820)表达而言。合适地，所述多 肽中的至少两个的表达水平比对SCN更加易感的植物中的水平高。合适地，所述多肽中的 全部三个的表达水平更高。可选择地或此外，编码Glymal8g02610、Glymal8g02590和/或 Glymal8g02580多肽的多核苷酸表达也可在更高水平。
[0013] 在另一个方面，本发明提供一种构建体，所述构建体包含与多核苷酸可操作连接 的启动子，所述多核苷酸编码含有SEQIDN0:1的Glymal8g02580多肽，含有SEQIDN0:2、 5或6的Glymal8g02590多肽、含有SEQIDN0:3的Glymal8g02610多肽的至少部分，或与 SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 具有至少 90% 同一 性的多肽，或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。所述构建体可用于生成转基因 植物或种子。
[0014] 在又一个方面，本发明提供一种包含外源或非固有多核苷酸的转基因植物，所 述多核苷酸编码含有SEQIDN0:1的Glymal8g02580多肽，含有SEQIDN0:2、5或6的 Glymal8g02590 多肽、含有SEQIDN0:4 的Glymal8g02600 多肽、含有SEQIDN0:3 的 Glymal8g02610 多肽的至少部分、或与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQID N0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6具有至少90%同一性的多肽、任何前述多肽的同源物或 功能部分或其组合、或者如本文所述的来自PI88788或Peking来源的多肽。所述转基因植 物对线虫、合适地胞囊形成线虫、合适地SCN具有增加的抗性。合适地，所述转基因植物包 含至少一个多核苷酸，其编码至少两个或至少三个编码Glymal8g02580、Glymal8g02590和 Glymal8g02610多肽的多核苷酸。
[0015] 在另一个方面，本发明提供一种包含编码能够增强对线虫（合适地胞囊形成线 虫，合适地SCN)抗性的多肽的多核苷酸的转基因细胞。所述多肽包括与SEQIDN0:1、SEQ IDNO: 2、SEQIDNO: 3、或与源自PI88788(例如，SEQIDNO: 5)或Peking来源（例如，SEQ IDN0:6)的相似序列具有至少90%同一性的多肽的至少部分、或其组合。合适的，所述多 核苷酸包括与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3具有至少90%同一性的多肽中的 至少两个或三个。
[0016] 在另一个方面，本发明提供一种通过引入外源多核苷酸来生成转基因植物的方 法，所述外源多核苷酸编码与SEQIDNO: 1具有至少90%同一性的Glymal8g02580多肽、 与SEQIDN0:2、5或6具有至少90%同一性的Glymal8g02590多肽、或者与SEQIDN0:3 具有至少90%同一性的Glymal8g02610多肽的至少部分、或其同源物或组合。所述转基因 植物在植物根细胞中具有增加的Glymal8g02610、Glymal8g02590和/或Glymal8g02580 表达。所述转基因植物与对照植物相比具有对线虫（合适地胞囊形成线虫，合适地SCN) 增加的抗性。合适地，所述转基因植物具有编码Glymal8g02610、Glymal8g02590和/或 Glymal8g02580多肽的多核苷酸中的至少两个或全部三个的增加的表达。
[0017] 在另一个方面，本发明提供鉴定分子的方法，所述分子与Rhgl基因座、Glymal8g02610、Glymal8g02590 和 / 或Glymal8g02580RNA转录本、或者Glymal8g02610、 Glymal8g02590和/或Glymal8g02580多肽相互作用。所述方法包括检测能够结合Rhgl基 因座、Glymal8g02610、Glymal8g02590 或Glymal8g02580RNA转录本、或者Glymal8g02610、 Glymal8g02590 或Glymal8g02580 多肽的分子。
[0018] 在另一个方面，本发明提供鉴定植物对胞囊线虫抗性或易感性表型的方法。所述 方法包括检测在第一植物细胞中与胞囊线虫抗性或易感性相关的遗传标志物，以及将第一 植物细胞中的遗传标志物与已知抗性或易感性表型的第二植物细胞中的遗传标志物或与 对照植物细胞中的遗传标志物进行比较。所述遗传标志物可以是序列变异、甲基化差异、 mRNA表达差异、小RNA产生或其它本文所鉴定的差异。合适地，所述遗传标志物与Rhg-1 基因座表征相关，例如本文所报告的那些。合适地，所述遗传标志物是Glymal8g02600、 Glymal8g02610、Glymal8g02590或Glymal8g02580的至少一个的基因组拷贝数。合适地， 所述植物是大豆以及所述线虫是SCN。
[0019] 在另一个方面，本发明提供增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括在细 胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码Glymal8g02610多肽、Glymal8g02590多肽、或 Glymal8g02580 多肽、与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 或SEQID N0:3具有90%或更多同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能变体或组合。合适 地，所述多核苷酸编码Glymal8g02610、Glymal8g02590或Glymal8g02580多肽中的至少两 个或全部三个。然后，所述多肽或编码所述多肽的细胞可以应用到所述植物、植物种子、或 种子可被种植的土壤。所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。
【附图说明】
[0020] 图1是SCN生命周期的图形描述。
[0021] 图2是使用人工microRNA序列靶向目的基因的一个基因沉默策略的图形描述。
[0022] 图3显示在rhgl-b有三个基因有助于SCN抗性。图3A是显示代表性的SCN感 染的根；使用酸性品红染色根微管束和线虫。在SCN-抗性的根中更少的线虫从J2进展到 J3、J4、成年雄性或充满卵的成年雌性（胞囊）阶段。图3B是图：其表明相对于Williams 82 (SCN-易感型）和未沉默的Fayette(SCN-抗性）对照，具有指定基因沉默的大豆品种 Fayette的转基因根中发育超越J2阶段的SCN。平均值土平均值的标准误。* :Fayette (沉 默的）显著不同于Fayette(未沉默的）基于ANOVAP〈0. 05。EV:使用空载体转化的。
[0023] 图4是一组图，其表明线虫发育受沉默水平影响。图4A和4C表明在Williams82 和转化了空载体（EV)的Fayette根中、或转化了沉默构建体（2580RNAi或ami2590)的 Fayette中线虫发育依赖于沉默水平。具有减少的靶转录本丰度的转基因根（+)显示的线 虫发育类似Williams82 (SCN-易感），而具有未沉默转录本水平的转基因根（-)具有类似 Fayette(SCN-抗性）的线虫发育。图4B和4D分别表明由qPCR测量的来自（A)或（C)的 根中的靶基因的转录本丰度。SKP16转录本作为参考，并归一化到Fayette-EV。图4B和4D 的结果被用来将根放入"良好沉默"(+)或"不良沉默"(_)分类中，如在图4A和4C中所示。 图4A和4B是Glymal8g02580。图4C和4D是Glymal8g02610。条形代表平均值土平均值 的标准误。
[0024] 图5表明提高编码基因表达的31. 2kb重复存在于Rhgl基因座的SCN-抗性单倍 型中。图5A是Williams 82的Rhgl基因座（上），和来自rhgl-b单倍型的5个福斯质粒 插入的示意图。大豆参考基因组的DNA序列显示两个指定位置。数字和区块图标指大豆基 因（如，Glymal8g02540)。福斯质粒#3、4和5携带跨重复接合处的rhgl-b基因组段。图 5B显示了来自四种不同来源的SCN抗性的Rhgl重复接合处序列（与在（图5A)中的参考 基因组序列相比）。图5C显示对应于图5A中以绿色显示的参考基因组区的全基因组鸟枪 测序读数数目的图，所述读数数目比18号染色体上rhgl-b相邻的基因组区、或11和2号 染色体的Rhgl-同源基因座大10倍。图?是显示在31kb重复区编码的基因转录本丰度 的