扩大t细胞的方法
【专利说明】扩大T细胞的方法
[0001] 本申请要求美国临时申请序号61/569, 577的优先权，其被引入本文作为参考。
[0002] 本发明涉及扩大T细胞--如自体T细胞、其衍生的细胞群--的新方法、包括所 述细胞群的药物组合物和该细胞和组合物用于治疗--特别是治疗或预防病毒感染和/或 癌症，例如，免疫抑制或免疫活性人患者--的应用。
[0003] 发明背景
[0004] 虽然病毒被广泛公认是感染性疾病的病因，某些病毒也与人癌症有关。人免疫系 统是控制病毒感染以及显示与致癌性病毒相关的恶性肿瘤的中心。在构成人免疫系统的细 胞、抗体和免疫调节分子的复杂排列中，胸腺起源的淋巴细胞（T细胞）对于控制病毒感染 和癌症具有中心作用。因此，一种预防或治疗病毒感染和癌症的方法已被采用，从这些患者 采集T细胞，并将其在体外刺激和/或扩大，然后将其输回患者体内。
[0005] 体内T细胞激活和抗原特异性扩大通常被认为源自两个信号过程，其中第一信号 通过T细胞受体/CD3复合物与递呈肽抗原的主要组织相容性复合物I类或II类分子（MHC I类或MHCII类）的连接而产生。MHCI类或MHCII类和肽复合物在细胞（抗原递呈细 胞或APC)表面上表达。肽抗原源自进行内生过程的细胞中的分子，并且可以是（1)体内天 然存在的"自身"抗原；（2)源自癌症相关突变的肿瘤抗原；或⑶与感染或癌症相关的病 毒抗原；等等。T细胞受体识别抗原被认为是第一信号，而第二信号产生自T细胞上另外的 表面分子与APC上另外的分子的连接所造成的共同刺激。可能需要T细胞和APC之间的这 些共同刺激分子的上调和连接来引起或促进T细胞激活，因为单独的第一信号可能不足以 将此实现。这两种信号激活可导致T细胞扩大，使得更大量的抗原特异性T细胞可被利用， 以控制引起免疫应答的病原或癌症。对这两种信号激活的权威理解基于相同的APC，其为响 应T细胞提供第一信号和第二信号，使得共同刺激与抗原识别直接相关。T细胞的体外激活 和扩大一直是漫长的、复杂的和资源密集型的过程。一般的方法可例如耗时8-12周，并且 通常利用活"靶"病毒和/或病毒载体来实现抗原递呈细胞（APC)的抗原递呈。通常，T细 胞激活/扩大需要静态条件，而非搅拌或物理搅动培养系统。
[0006] 培养识别EB病毒（EpsteinBarrVarus，EBV)的LMP1和LMP2抗原的抗原特异性 T细胞的一个现有技术方法可概括如下：
[0007] 预备步骤
[0008] ?为了以可控方式实现两信号T细胞激活和扩大方法，通过取自患者的B细胞 的转染生成抗原递呈细胞是可用的。这被称为建立自体类淋巴母细胞细胞系，并且通过 用EBV(EBV-LCL)感染细胞进行。其耗时约6-8周以建立该细胞系，因此其是作为依赖于 EBV-LCL以进行抗原递呈的培养方法的一部分必须开始的初始阶段之一。其如下制备：在 环胞素A存在派生副产物（outgrowth)和LCL消除。
[0009] 0在利用EBV-LCL的扩大步骤前，培养系统包括，通过已转导有病毒载体 Ad5f35-LMP1-LMP2 (编码EBV蛋白LMP1和LMP2)的自体树突细胞，初始激活和扩大LMP-1 和LMP-2特异性T细胞（第0至8天）。
[0010]〇第9至12天，收集溶细胞性T淋巴细胞（CTL)，并将其再悬浮于新制培养基中， 并用转导有Ad5f35-LMP1-LMP2的EBV-LCL再刺激。
[0011] 〇第13至16天，向溶细胞性T淋巴细胞供给新制培养基和重组人IL-2。
[0012] 〇然后是利用CTL:LCL每周再刺激，和每周两次添加IL-2,持续4至8周时间。
[0013] 〇用于该方法的树突细胞也必须通过如下制备：从患者样品获取PBMC，并 用IL-4和GM-CSF将其激活，以提供粘附PBMC。然后使这些细胞转导有病毒载体 Ad5f35-LMP1-LMP2(即，编码EBV蛋白LMP1 和LMP2)。最后，通过添加IL-1P、IL-6、PGE-1 和TNF-a使得树突细胞成熟。
[0014]T细胞扩大步骤概述
[0015](也被称为细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的制备）
[0016] ?在制备后，将转导的树突细胞与来自患者的新制PBMC-起培养约10天时间。
[0017] ?然后将得自此步骤的T细胞与转导的EBV-LCL-起培养约1周时间。
[0018] ?然后在IL-2存在的情况下将得自后者步骤的T细胞与转导的EBV-LCL-起再培 养10天，以提供自体T细胞抗原特异性产物。
[0019] ?反复此过程，直到已扩大足够的T细胞。
[0020] JImmunotherVol33，Number3,2010年4月描述了更快速并且更有效的培养细 胞的方法，其经23天时间，利用来自WilsonWolf的被称为GRex?系统的系统。但是，这种 快速方法仍然对细胞应用传统病毒刺激。
[0021] 现有技术策略具有多个问题：
[0022] (i)活病毒如EBV和病毒载体的应用有可能引起抗载体免疫显性应答，其可干扰 靶病毒特异性CTL's的有效生成；
[0023] (ii)活病毒的应用由于安全顾虑是进展至3期试验的障碍；
[0024] (iii)B细胞制备EBV-LCL的要求，既然利妥昔单抗（Rituxan)(其减少B细胞）已 成为大多数淋巴瘤患者的标准治疗，意味着该技术无法用于多数患者；
[0025] (iv)生产期（最少6周以建立EBV-LCL和另外5至7周以用于CTL扩大）非常不 便，不现实并且经济困难；
[0026] (v)细胞调控的复杂性提供很多产物错误和污染机会，因此，良好生产规范（GMP) 的准则难以符合，和
[0027] (vi)用于刺激T细胞扩大的自体抗原递呈细胞可表达靶抗原之外的抗原，其可降 低治疗性T细胞产物所需的抗原特异性T细胞的纯度。
[0028] 然而，技术人员一直不愿从偏离已建立的方法，因为每个步骤都被认为是生成具 有治疗性特征的产物，特别是生成适于在体内识别被活病毒感染的细胞和癌症表达病毒抗 原的T细胞群所必需的。
[0029] 本公开提供快速和有效生产对靶抗原具有特异性的抗原特异性T细胞的方法。
[0030] 发明概述
[0031] 本公开提供体外扩大（扩张）抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法， 包括如下步骤：
[0032]a)在存在下列的情况下，培养自体PBMC群：
[0033] i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原 (一种或多种）相关的肽/肽混合物，和
[0034] ii)至少一种细胞因子，和
[0035] b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群：
[0036] i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与 靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞（T-APC's)细胞， 和人造共同刺激因子，和
[0037] ii)任选地，细胞因子，并且
[0038] 其特征在于，该方法在相关T细胞群的扩大中，不应用活病毒和/或病毒载体，或 编码抗原的DNA或RNA。
[0039] 在一个实施方式中，提供体外扩大自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤：
[0040] a)在存在下列的情况下，培养自体PBMC群：
[0041] i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽混合物脉冲的树突细胞，和
[0042] ii)至少一种细胞因子，和
[0043] b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群：
[0044] i)已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞 (T-APC's)细胞和人造共同刺激因子，
[0045] ii)细胞因子，和
[0046] 其特征在于，该方法在相关T细胞群的扩大中不应用活病毒和/或病毒载体或编 码抗原的DNA或RNA。
[0047] 在本公开的方法中，步骤a)的PBMC或树突细胞和步骤b)的抗原递呈细胞通常用 肽脉冲（也被称为负载），该肽被选择以显示来自靶抗原的表位。这些肽在下文中得到更详 细的讨论。
[0048] 我们通过如下克服了现有技术的问题：
[0049] ?消除生成EBV-LCL's的需要，因此避免活病毒用于抗原递呈（这允许来自此前 B细胞已耗尽--例如利妥昔单抗治疗导致--的患者的抗原特异性T细胞生成）
[0050] ?消除利用病毒载体-或DNA-或RNA-编码的抗原实现抗原表达和在抗原递呈细 胞中的递呈的需要
[0051] ?提供消除DC对于抗原递呈应用的选择
[0052] ?提供T细胞激活方法，其中通过自体细胞群提供刺激信号和通过重组细胞系或 人造共同刺激复合物提供共同刺激信号
[0053] ?提供有效且稳健的2步培养方法，在三周或更少时间内生成共计例如>10e7的具 有适当抗原特异性的⑶3T淋巴细胞。
[0054] ?集中对临床相关病毒抗原具有特异性的T细胞的刺激，如另外被在2型潜伏肿瘤 (淋巴瘤和NPC)中不表达的抗原控制的EBV抗原。
[0055] 本发明对于生产自体T细胞产物具有显著优势，并且有可能致使治疗可用于更广 泛的患者群。其还最小化生产治疗性产物所需的时间、干预和资源量，并且还有利地最小化 污染的可能。
[0056] 此外，获得的治疗性产物的特异性和性质至少等同于通过现有技术方法生产的产 物，并且在多个方面可具有改善的性质。
[0057] 某些患者如癌症患者的自体细胞不同于得自健康个体的细胞，因为患者细胞被发 现是无反应性的，即，不能递送针对与感染或癌症相关的抗原的免疫应答。免疫抑制通常被 认为是全身性的，而无反应性通常在抗原特异性基础被描述，其中T细胞的具体克隆不再 能够递送针对靶抗原的免疫应答。癌症微环境例如可产生无反应性，使得识别癌症抗原的 T细胞不再具有功能性。
[0058] 免疫无反应性或抑制的证据是，例如，不能清除病毒感染和/或病毒相关癌症 细胞的存在。在健康个体中，这些细胞被免疫系统清除（Teague，R.M.，B.D.Sather，J. A.Sacks,M.Z.Huang,M.L.Dossett,J.Morimoto,X.Tan,S.E.Sutton,M.P.Cooke,C.Ohlen 和P.D.Greenberg. 2006.Interleukin_15rescuestolerantCD8+Tcellsforusein adoptiveimmunotherapyofestablishedtumors.Nat.Med. 12:335-341,和Chemnitz,J. M. ,D.Eggle,J.Driesen,S.Classen,J.L.Riley,S.bey-Pascher,M.Beyer,A.Popov,T. Zander和J.L.Schultze. 2007.RNAfingerprintsprovidedirectevidenceforthe inhibitoryroleofTGFbetaandPD-lonCD4+TcellsinHodgkinlymphoma.Blood 110:3226-3233)。
[0059] 此外，在患有鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma,NPC)的患者体内，利用抗原特 异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)进行自体T细胞免疫治疗的结果一直是相对无效的。在一 个试验中，11个患者中仅1个具有完全应答，这可由不能再激活这些患者的LMP特异性T细 胞来解释。事实上，发明人假设NPC使具有病毒肿瘤抗原特异性的T细胞无反应性。
[0060] 因此，在一些患者中，现有技术方法不能足够地再激活适当的抗原特异性T细胞。
[0061] 注入的T细胞的效力不仅取决于其识别靶肿瘤抗原的能力，还取决于识别那些抗 原中的多个表位以防止肿瘤由于表位损失、病毒株变异和T细胞引起的突变而逃脱。因此， 需要研发可再现地再激活和扩大识别抗原的广谱表位--如在NPC和EBV阳性淋巴瘤中表 达的LMP1-、L