多链嵌合抗原受体和其用图

多链嵌合抗原受体和其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及嵌合抗原受体（CAR)。利用配体结合结构域特性，CAR能够针对所选择 的靶重定向免疫细胞特异性和反应性。特别是，本发明涉及多链嵌合抗原受体，其中用不同 的跨膜多肽分离胞外配体结合和信号域以改善它们的功能。构成本发明的多链CAR的不同 跨膜多肽，一旦组装在一起可特异性地结合至靶标中的一个或几个配体并诱导免疫细胞的 活化，其中它们被表达且是免疫应答。本发明还涉及编码此类跨膜多肽的多核苷酸、载体， 以及用于免疫治疗的在其表面表达所述多链CAR的分离的细胞。本发明还涉及用于工程化 在其表面表达多链CAR的免疫细胞的方法。本发明开辟了对用于治疗癌症和病毒感染的有 效的继承性（adoptive)免疫治疗策略的道路。
【背景技术】
[0002] 继承性免疫治疗，其涉及离体（ex vivo)产生的自体抗原特异性T细胞的转移，是 治疗病毒感染和癌症的有前途的策略。可以通过基因工程由抗原特异性T细胞的扩增或T 细胞的重定向产生用于继承性免疫治疗的T细胞（Park, Rosenberg et al. 2011)。病毒抗 原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关病毒感染和罕见病毒相关恶性肿瘤的成熟过 程。同样地，已经示出肿瘤特异性T细胞的分离和转移成功治疗黑素瘤。
[0003] 已经通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体（CAR)的遗传转移成功产生T细胞 中的新的特异性（Jena, Dotti et al. 2010)。CAR是由祀向部分组成的合成受体，祀向部 分与单个融合分子中的一个或多个信号域相关。在一般情况下，CAR的结合部分由单链抗 体的抗原结合结构域（scFv)组成，其包括通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻且可变的 片段。也已成功地使用基于受体或配体结构域的结合部分。对于第一代CAR的信号域源 自⑶3 G (zeta)或Fc受体y (gamma)链的胞质区域。第一代CAR已经示出成功地重定向 T细胞细胞毒作用，然而，它们未能提供体内（in vivo)长期扩增和抗肿瘤活性。已经单 独（第二代）或组合（第三代）加入来自包括CD28、0X-40(CD134)和4_1BB(CD137)的共 刺激分子的信号域以提高存活并增加CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已成功允许T细胞针 对抗原被重定向，该抗原在来自包括淋巴瘤和实体瘤的各种恶性肿瘤的肿瘤细胞表面表达 (Jena, Dotti et al. 2010)〇
[0004]目前CAR结构建立在其中所有相关结构域包括在单个多肽内的设计上（US 7, 741，465)。这种设计使连续附加的信号域成为必须，因此使得从它们的自然近膜位置、远 离质膜移动一些结构域成为必须。然而，其中配体和信号域在它们的正常近膜位置（即相 邻于它的内侧的细胞膜）分离的结构，将是更为期望的并认为允许共刺激结构域的改善功 能。对于IgE(Fc e RI)的高亲和力受体可以负担此类结构。的确，Fc e RI，其存在于肥大 细胞和嗜碱性粒细胞上，是由配体结合性a (alpha)亚基、0 (beta)亚基和两个信号转导 y亚基的同型二聚体组成的四聚体复合物（Metzger，Alcaraz et al.1986)。FceRIa结 构域由含有两个结合IgE的Ig样结构域的胞外结构域、跨膜结构域和短胞质尾区（tail) 组成。0亚基包括四个跨膜区段（segment)分离氨基和羧基末端胞质尾区。 Y链基本上 由跨膜区域和含有一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAM)的胞质尾区组成（Cambier 1995)〇
[0005] 使用继承性免疫治疗用于治疗患者的当前方案基于自体细胞转移。在这种方法 中，从患者回收T淋巴细胞、离体遗传修饰或选择、体外培养以如果必要扩增细胞的数量并 最后注入到患者。除了淋巴细胞注入，可以其他方式被操纵宿主，其他方式支持T细胞的植 入或它们参与免疫应答，例如淋巴细胞生长因子（如IL-2)的预调节（用放疗或化疗）和 给予。使用患者自身淋巴细胞（即自体疗法），每个患者接受单独制造的治疗。
[0006] 面临对实际应用的大量技术和逻辑障碍的自体疗法，它们的产生需要昂贵的设备 和专家人员，在患者的诊断后必须在短时间内产生它们，并在许多情况下，患者的预治疗导 致退化的免疫功能，使得患者的淋巴细胞功能不佳且以非常低的数量存在。因为这些障碍， 每个患者的自体细胞制剂有效地为新产品，从而导致在有效性和安全性上显著变化。理想 地，人们希望使用标准化治疗，其中可以预先制造、详细表征同种异体治疗细胞，并且可以 用于立即给予至患者。同种异体是指，细胞是从属于相同物种但在遗传上不一样的个体获 得的。然而，同种异体细胞的使用目前具有许多缺点。在免疫活性的（competent)宿主中 同种异体细胞被迅速排斥，这是被称为宿主抗移植物反应（HvG)的过程，并且这显著限制 了转移的细胞的有效性。在免疫非活性的宿主中，同种异体细胞能够移入，但它们的内源 TCR特异性地将宿主组织识别为异体的（foreign)，导致移植物抗宿主病（GvHD)，其可以导 致严重的组织损伤和死亡。为了有效地使用同种异体细胞，必须克服这两个问题。
[0007] 在免疫活性的宿主中，同种异体细胞被宿主免疫系统迅速排斥。已经证实，存 在于非照射的血液产品中的同种异体白细胞将持续不超过5至6天（Boni，Muranski et al. 2008)。因此，为了防止同种异体细胞的排斥，必须有效地抑制宿主的免疫系统。糖皮 质类固醇在治疗上广泛用于免疫抑制（Coutinho and Chapman 2011)。这类类固醇激素 结合至存在于T细胞的胞液中的糖皮质激素受体（GR)，导致进入细胞核的易位和特异性 DNA基序的结合，其调节一些参与免疫过程的基因的表达。用糖皮质类固醇治疗性T细 胞的导致细胞因子产生的降低水平，导致T细胞无反应性且干扰T细胞活化。阿仑单抗， 也称为CAMPATH1-H，是靶向⑶52的人源化单克隆抗体，是12种氨基酸糖基磷脂酰肌醇 (glycosylphosphatidyl_inositol，GPI)连接的糖蛋白（Waldmann and Hale 2005)。CD52 在T和B淋巴细胞上以高水平表达并且在单核细胞上以较低水平表达，同时不存在于粒细 胞和骨髓前体上。用阿仑单抗（针对CD52的人源化单克隆抗体）治疗已经示出诱导循环 淋巴细胞和单核细胞的快速耗尽。它经常在T细胞淋巴瘤的治疗中并且在某些情况下作为 用于移植的预处理方案的部分使用。然而，在继承性免疫治疗的情况下，使用免疫抑制性药 物也会对引入的治疗性T细胞有不利影响。因此，在这些条件下为了有效地使用继承性免 疫治疗方法，将需要引入的细胞耐免疫抑制性治疗。
[0008] 另一方面，T细胞受体（TCR)是细胞表面受体，其参与T细胞活化以响应于抗原呈 递。TCR通常由两条链，a和0制成，其组装以形成异源二聚体且与⑶3转导亚基关联以形 成存在于细胞表面上的T细胞受体复合物。TCR的每条a和0链由免疫球蛋白样N-末端 可变（V)区和恒定（C)区、疏水跨膜结构域和短胞质区域组成。至于免疫球蛋白分子，通过 V(D)J重组，在T细胞群体内产生抗原特异性的大的多样性产生a和0链的可变区。然而， 与识别完整抗原的免疫球蛋白形成对比，由与MHC分子相关的加工的肽片段活化T细胞，由 T细胞引入额外维度以抗原识别，被称为MHC限制。通过T细胞受体识别供体和受体之间的 MHC差异导致T细胞增殖和GVHD的潜在发展。已经示出，TCR的正常表面表达取决于复合 物的所有七种组分的协调合成和组装（Ashwell and Klusner 1990)。TCRa或TCR0的失 活可导致从防止识别同种异体抗原以及因此GVHD的T细胞表面的TCR消除。然而，TCR中 断（disruption)导致⑶3信号转导组分的消除且改变进一步T细胞扩增的方式。
[0009] T细胞介导的免疫包括由共刺激和微调免疫应答的抑制信号之间的平衡调节的 多个顺序步骤。被称为免疫检查点的抑制信号对于维持自身耐受性至关重要，且还限制免 疫介导的附带（collateral)组织损伤。可由肿瘤下调免疫检查点蛋白的表达。肿瘤吸纳 (co-opt)这些抑制通路的能力代表免疫抗性中的重要机制，且限制免疫治疗的成功。活 化治疗性T细胞免疫应答的有前途方法之一是阻滞这些免疫检查点（Pardoll 2012)。免 疫检查点代表活化癌症中功能性细胞免疫的显著障碍，且对于包括CTLA 4和程序性死 亡-1 (PD-1)的T细胞上的抑制配体特异的拮抗抗体是在临床中进行评估的靶向剂的实例。
[0010] 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4 ;也称为⑶152)下调T细胞活化的幅度， 且用诘抗剂CTLA4抗体（伊匹单抗（ipilimumab))的治疗已经示出患有黑素瘤的患者中的 生存益处（Robert and Mateus 2011)。程序性细胞死亡蛋白1(PD1或roCDl，也称为CD279) 代表对于免疫疗法的另一个非常有前途的靶（Pardoll and Drake 2012 ;Pardoll 2012)。 与CTLA-4形成对照，PD1在对感染的炎性反应时限制周组织中的T细胞效应子功能，且限 制自身免疫。用PD1抗体的第一个临床试验示出肿瘤消退的一些案例（Brahmer，Drake et al. 2010)。多个另外的免疫检查点蛋白代表基于最近研宄用于治疗阻滞的有前途的靶。
[0011] 在正常T细胞中，T细胞受体源自前T细胞受体（pTCR)，其由不成熟的胸腺细胞 表达并且对于从双阴性（⑶4-⑶8_)到双阳性（⑶4+⑶8+)阶段的T细胞发育至关重要。在 TCR0基因座的生产性重排方面成功的前T细胞表达功能性TCR0链，其与不变的前T a链 (preTalpha)和⑶3信号转导组分配对以形成前TCR复合物。前TCR在细胞表面的表达对 于引发选择有必要，选择是诱导发育中的T细胞扩增、执行TCR0基因座的等位排 斥并且导致在TCRa基因座处重排的感应的过程（ von Boehmer 2005)。在生产性TCRa重 排和由TCR a取代PT a以形成成熟TCR后，一经结合在胸腺上皮细胞上表达的自身肽MHC 复合物，胸腺细胞进行选择的第二步骤，被称为阳性或TCRa/0选择。因此，成熟T细胞通 过它们的TCR识别并应答抗原/MHC复合物。TCR活化的最直接后果是经由关联⑶3亚基起 始信号转导通路，其引起包括克隆性扩增T细胞、上调细胞表面上活化标志物和诱导细胞 毒性或细胞因子分泌在内的多个事件。
[0012] 由于在胸腺发育期间通过与前Ta配对来选择TCR0链的性质，因此，在其中 TCRa已被失活的T细胞中，异源引入pTa转基因可引起前TCR的形成。该pTCR可以充当 以非MHC依赖性的方式的T细胞活化或刺激的工具，从而例如允许TCRa失活之后的a / 0 T细胞的持续扩增。重要地，在关联的⑶3亚基方面，pTCR复合物显示与TCR相似的生化 组分（Carrasco, Ramiro et al. 2001)。另外，与TCR形成对照，前TCR信号转导可由配体独 立事件部分地发生。PTCR胞外结构域的晶体结构已经为pTCR信号转导的可能的配体独立 提供结构基础。已经示出PTCR形成头尾二聚体，其中两个pTa-TCRf3异源二聚体相关联 (Pang, Berry et al. 2010) 〇
[0013] 在开发可以靶向恶性或感染细胞的治疗级工程化免疫细胞的背景中，本发明人寻 求改善的CAR结构，其会更接近于天然的那些，并且很可能因此的使用任何胞外单或多特 异性配体结合结构域的行为。
[0014] 作为结果，他们已设计了新一代CAR，根据本发明其涉及分离的多肽亚基，称为"多 链 CAR"。

【发明内容】

[0015] 在现有技术中的嵌合抗原受体（CAR)以单个融合分子存在，其需要信号域的连续 附加。然而，从它们的天然近膜位置去除信号域干扰它们的功能。因此，为了克服这个缺点， 本发明人已成功设计所谓的多链CAR，其允许所有有关信号域的近膜位置。在多链CAR中， 信号域被放置在不同的多肽链上，以使得它们位于近膜位置。例如，通过由胞外配体结合结 构域如scFv替代Fc e RI a链的高亲和性IgE结合结构域，多链CAR可以衍生自Fc e RI，然 而Fc e RI 0和/或Y链的N和/或C-末端尾用于将信号转导结构域放置在正常近膜位 置。胞外配体结合结构域具有向细胞靶重定向T细胞特异性的作用，同时置于近膜位置的 信号转导结构域活化免疫细胞应答。
[0016] 在近膜位置的信号域存在于与携带胞外配体结合结构域不同的多肽上的事实，为 CAR提供更灵活的结构。因此，取决于在CAR的配体结合结构域和其受体之间寻求的相互 作用强度，可以添加另外的信号域或共刺激结构域或从CAR去除它们。这种在CAR结构中 的灵活性也允许引入另外的一个或多个胞外配体结合结构域。这可以通过将第二配体结合 结构域融合至携带第一配体结合结构域的多肽，或通过引入另外的胞外配体结合结构域完 成。如果该第二配体结合结构域具有不同的特异性，那么形成双特异性多链CAR，并且如果 有另外的特异性，那么形成多特异性多链CAR。鉴于靶向给定细胞或携带在它们的表面存 在的两个或多个不同受体的病毒，这些是特别有利的。这增加此类多链CAR对所述细胞或 病毒的特异性。在另一方面，信号域的数量可以允许对于不同结合结构域分别地调节信号。 此外，可以以不同的表达水平独立地表达形成CAR的每个重组多肽以进一步调节CAR的活 性。
[0017] 本发明被吸引到这种新的CAR结构、编码其的重组多核苷酸、以及工程化对于特 异性细胞识别的免疫细胞的方法，不论免疫细胞的目的和性质。
[0018] 本发明另外地提供用于制造此类更适用于免疫治疗目的免疫细胞的方法。
[0019] 例如，特别是，通过在原代细胞中失活TCR a或0基因和/或通过结合使编码对 于不同免疫抑制剂的靶、特别是CD52和GR(糖皮质激素受体）的基因的失活并进一步选择 耐所述免疫抑制剂的细胞，免疫细胞可以被进一步工程化以成为非同种反应性的和/或耐 免疫抑制剂。
[0020] 除了遗传修饰的免疫细胞的以上描述的概念，本发明还涉及这样的实施方式，其 中当TCRa被失活时，例如通过在细胞中瞬时表达前T a从而在不存在功能性a/0TCR的 情况下修复功能性CD3复合体，免疫细胞被工程化以允许增殖。
[0021] 为了工程化遗传地高活性修饰的免疫细胞，本发明还提供了这样的方法，其中由 缺乏基因如PD1和CTLA-4的表达阻断免疫检查点。
[0022] 本申请进一步公开了工程化的免疫细胞特别是将用作药物的T细胞，更特别是， 用于通过将此类免疫细胞给予至生物体治疗或预防癌症。
[0023] 附图和附表的简要说明
[0024] 除了前述特征，本发明进一步包括其他特征，其会从以及跟随附图的描述显露。将 容易地获得本发明的更完整评价和其许多附带的优点，由于本发明的更完整评价和其许多 附带的优点通过参考结合下面详细描述的下列附图变得更好理解。
[0025] 图1 :T细胞和抗原呈递细胞之间的正常关系的示意图。
[0026] 图2:根据本发明的遗传修饰的治疗性T细胞和患者的肿瘤细胞的示意图。
[0027] 图3:多链CAR示意图。
[0028] 图4:不同版本的多链CAR的示意图。A. Fc e RI受体的示意图。B-C不同版本的多 链CAR(csml至csmlO)，包括融合至Fc e RI a链的跨膜结构域的scFv和⑶8莖区（stalk region)。至少一个41BB、CD28和/或CD3 (结构域可以融合至Fc e RI a、0和/或y 链。
[0029] 图5 :工程化用于免疫治疗的人类同种异体细胞的方法的一个实例的示意图。
[0030] 图6:在用抗⑶52抗体（CAMPATH1-H)连同补体或对照处理后，活⑶52阳性或⑶52 阴性细胞的以细胞/毫升计的浓度。
[0031] 图7:在TCR阳性和TCR阴性细胞之间，或在⑶52阳性和⑶52阴性细胞之间，并 且以非活化细胞作为对照的前侧向散射（FSC)分布（这是细胞尺寸的指标）的比较。
[0032] 图8:在靶向的⑶52和TCRa失活的T细胞上的⑶107a表达（脱粒 (degranulation)的标志物）的流式细胞仪分析。在用Daudi细胞孵育之前（A)和之后 (B)，在 CD52+TCR a 0 + 细胞（第一列）、CD52_TCR a 0 -细胞（第二列）、CD52_TCR a 0 + 细 胞（第三列）和⑶52+TCR a 0 -细胞（第四列）上分析⑶107表达；C)代表用CAR进一步 转染并且用Daudi细胞孵育的T细胞的流式细胞仪分析；D)代表用CAR转染但不用Daudi 细胞孵育的T细胞的流式细胞仪分析，和E)代表用CAR转染且以PMA/离子霉素（阳性对 照）处理的T细胞的流式细胞仪分析。
[0033] 图9 :CD52和TRAC TALE核酸酶潜在脱位点（off-site)靶的深度测序分析。图9 公开了"左半靶"序列为SEQ ID N0:149-165和"右半靶"序列为SEQ ID N0 166-182,所有 分别按出现的顺序。
[0034] 图10:通过17核酸内切酶分析的ro⑶1和CTLA-4基因组基因座的分析。箭头指 向消化的PCR产物。
[0035] 图11:前Ta构建体的一些实例的示意图。
[0036] 图12:在TCRa失活的Jurkat细胞中，FL、A 18、A48pTa构建体（％ CD3表面表 达）的转导效率（％ BFP+细胞）和活性的流式细胞仪分析。
[0037]图13:编码pTa蛋白（前TCRa)的慢病毒构建体的示意图。
[0038]图14 :A.实验方案的表示。B.在TCRa失活的T细胞（K0)上TCRa /0、⑶3表达 和BFP表达的流式细胞仪分析，该T细胞在纯化前和纯化后用BFP-2A-pT a A 48 (K0/ A 48) 或对照BFP慢病毒载体（K0/BFP)转导。C.在纯化的TCRa失活细胞上的TCRa/f3和⑶3 表达的流式细胞仪分析，该细胞用BFP-2A_pTa A48慢病毒载体转导（BFPwtt)或不转导 (BFPpjm)。NEP代表具有TRAC TALE核酸酶的非电穿孔细胞。
[0039] 图15 :A_B.分别在非电穿孔细胞（NEP)和TCRa失活细胞（K0)上，用抗CD3/ CD28珠重新活化后24小时和48小时，早期活化标志物CD69 (A)、晚期活化标志物CD25 (B) 表达的流式细胞仪分析，上述的细胞用BFP-2A-pT a - A 48慢病毒载体（pT a - A 48)， BFP-2A_pT a - A 48. 41BB 慢病毒载体（pT a - A 48. BB)或对照 BFP 载体（BFP)转导。 PTa-A48直方图对应于在表达pTa-A48的TCR失活细胞（BFP+细胞）中检测到的信号， 而K0直方图对应于不表达pTa -A48的TCRa失活细胞（BFP-细胞），pTa -A48.BB直 方图对应于在表达pTa-A48. 41BB的TCR失活细胞（BFP+细胞）中检测到的信号，而K0 直方图对应于不表达pTa-A48. 41BB的TCRa失活细胞（BFP-细胞）。NEP(非电穿孔） 直方图对应于在非工程化细胞中检测到的信号。C.在非电穿孔细胞（NEP)和TCRa失活 细胞（K0)上，用抗CD3/CD28珠重新活化后72小时，细胞尺寸的流式细胞仪分析，上述的 细胞用 BFP-2A-pT a - A 48 慢病毒载体（pT a - A 48)、BFP-2A-pT a - A 48. 41BB 慢病毒载体 (pT a -A48.BB)或对照BFP载体（BFP)转导。每幅图的上半部分中表示的值对应于每个群 体的荧光的几何平均值。
[0040] 图16 :用pT a - A 48 (pT a A 48)或对照BFP载体（BFP)转导的TCR a失活细胞 (K0)的细胞生长分析，其在不同时间点（x轴）保持在IL2或具有抗CD3/CD28珠的IL2 中。在不同时间点对于每个条件评估BFP+细胞数并且相对于重新活化后第2天获得的值 评估这些细胞的倍数诱导（y-轴）。从两个独立供体获得结果。对于第二供体，还对于用 pT a - A 48. 41BB (pT a - A 48. BB)和全长pT a - (PT a-FL)转导的细胞确定细胞生长。
[0041] 图17:对用五种不同Cytopulse程序电穿孔的PBMC的GFP阳性细胞的流式细胞 仪分析。A.NEP、EP#1(GFP)和 EP#2(GFP) ;B.EP#3(pUC)，EP#4(GFP)和 EP#5(GFP)。上部线 对应于6 X 106细胞/小杯（cuvette)的转染，而下部线对应于3 X 10 6细胞/小杯的转染。
[0042] 图18:在用GFP mRNA、GFP DNA和对照pUC DNA电穿孔后，使用存活性（viability) 染料（eFluor-450)的纯化的T细胞死亡率和存活群体中的GFP阳性细胞的流式细胞仪分 析。A. NT 和 NEP ;B. EP (无 DNA)和 GFP DNA ;C. pUC DNA 和 GFP mRNA。NEP 对应于保持在电 穿孔缓冲液中但没有电穿孔的细胞并且NT对应于保持在培养基中的非电穿孔细胞。
[0043] 图19 :跟随着TRAC TALE核酸酶mRN