c)包括Fc e RIY链的部分的一种多肽，借此，不同的多肽自发地多聚在一起以形 成二聚的、三聚的或四聚的CAR。
[0097] 在优选的实施方式中，本发明的多链CAR包括具有选自由SEQ ID NO: 202至SEQ ID NO:204组成的组的氨基酸序列的多肽的部分。
[0098] 本文所使用的术语"…的部分"是指分子的任何子集，其是更短的肽。可替代地， 可以通过在编码该多肽的DNA中的突变制备多肽的氨基酸序列功能性变体。此类变体或 功能性变体包括例如从氨基酸序列内的残基的缺失，或者氨基酸序列内的残基的插入或取 代。也可以制作缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所 期望的活性，尤其是表现出特异性抗靶细胞免疫活性。宿主细胞内的本发明多链CAR的功 能在适合于证明结合特定的靶之后所述多链CAR的信号转导潜能的分析中是可检测的。此 类分析对本领域技术人员是可用的。例如，该分析允许检测结合靶之后引发的信号转导通 路，如涉及以下项产量的增加的测定的分析：钙离子释放、胞内酪氨酸磷酸化、磷酸肌醇转 换（turnover)、或白介素（IL)2、干扰素丫、61^5?、11-3、11-4产量，因而实现。
[0099] 作为非限制性实例，在图4中示出不同版本的多链CAR。在更优选的实施方式中， 本发明的多链CAR包括具有选自由SEQ ID N0:206至SEQ ID N0:213组成的组的氨基酸序 列的多肽。在优选的实施方式中，多链CAR包括具有这样的氨基酸序列的多肽：该氨基酸序 列具有与选自由SEQ ID N0:206至SEQ ID N0:213组成的组的氨基酸序列至少70%、优选 至少80%、更优选至少90%、95%、97%或99%的序列同一性。
[0100] 多核苷酸，裁体:
[0101] 本发明还涉及编码根据本发明的以上描述的多链CAR的多核苷酸、载体。本发明 提供包括编码可以包括在多链CAR中的本文所公开的跨膜多肽的DNA和RNA分子的多核 苷酸。特别是，本发明涉及包括编码构成如上所描述的多链CAR的至少一种跨膜多肽的核 酸序列的多核苷酸。更特别是，本发明涉及包括两个或多个编码构成如上所描述的多链 CAR的跨膜多肽的核酸序列的多核苷酸。在优选的实施方式中，本发明涉及选自由：SEQ ID NO:214至SEQ ID NO:223组成的组的多核苷酸。在优选的实施方式中，多核苷酸具有与选 自由SEQ ID N0:214至SEQ ID N0:223组成的组的核酸序列至少70%、优选至少80%、更 优选至少90%、95%、97%或99%的序列同一性。
[0102] 多核苷酸可存在于表达盒或表达载体中（例如用于引入到细菌宿主细胞的质粒， 或病毒载体，如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体，或质粒或病毒载体，如用于转染哺 乳动物宿主细胞的慢病毒）。
[0103] 在【具体实施方式】中，不同的核酸序列可以包括在一种多核苷酸或载体中，其包括 编码核糖体跳读（skip)序列的核酸序列，如编码2A肽的序列。2A肽，其在小核糖核酸病 毒的口蹄疫病毒亚组中被识别，引起从一个密码子到下一个密码子的核糖体"跳读"而不 形成由该密码子所编码的两个氨基酸之间的肽键（参见Donnelly et al.，J. of General Virology 82:1013-1025(2001) ；Donnelly et al. , J. of Gen. Virology 78:13-21 (1997)； Doronina et al. , Mol. And. Cell. Biology 28 (13):4227-4239(2008) ；Atkins et al. , RNA 13:803-810 (2007))。"密码子"是指在mRNA上（或在DNA分子的有义链上）的3个核苷酸， 其由核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽由在框中（in frame)的2A寡肽序列分 离时，可以从在mRNA内的单个、连续的开放阅读框合成两个多肽。此类核糖体跳读机制是 本领域中公知的并且已知被用于表达由单个信使RNA所编码的几种蛋白的几种载体使用。 作为非限制性实例，在本发明中，2A肽已用于表达多链CAR的不同多肽到细胞。在更优选的 实施方式中，本发明涉及选自由：SEQ ID N0:224至SEQ ID N0:232组成的组的多核苷酸。
[0104] 为了将跨膜多肽如Fc e R引导进入宿主细胞的分泌通路，在多核苷酸序列或载体 序列中提供分泌信号序列（也称为前导序列，前原（prepro)序列或前序列）。分泌信号序列 可以是FceR的序列，或可以源自另一种分泌蛋白（例如，t-PA)或从头合成的。分泌信号 序列可操作地连接至跨膜核酸序列，即，两个序列在正确阅读框中连接（join)并且定位以 将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌通路。分泌信号序列通常位于编码感兴趣多肽的核 酸序列的5'，尽管某些分泌信号序列可位于感兴趣核酸序列中的别处（参见，例如，Welch et al.，U. S.专利号 5, 037, 743 ;Holland et al.，U. S.专利号 5, 143, 830)。在优选的实施 方式中，信号肽包括Fc e RI a链（NP_001992. 1)的残基1至25并且具有氨基酸序列SEQ ID NO:205。
[0105] 本领域技术人员将认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中大 量的序列变异是可能的。优选地，本发明的核酸序列被密码子优化用于在哺乳动物细胞中 表达，优选用于在人类细胞中表达。密码子优化是指在给定物种的高度表达的基因中通常 是罕见的感兴趣的密码子被在该物种的高度表达的基因中通常是常见的密码子的序列中 的交换，这样的密码子与被交换的密码子编码相同的氨基酸。
[0106] 在优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括选自由：SEQ ID N0:214至SEQ ID N0:223的组的核酸序列。本发明涉及包括这样的核酸序列的多核苷酸，其具有与选自 由SEQ ID N0:214至SEQ ID N0:222组成的组的核酸序列至少70%、优选至少80%、更优 选至少90%、95%、97%或99%的序列同一性。
[0107] 工稈化免痔细朐的方法:
[0108] 在所包括的【具体实施方式】中，本发明涉及制备用于免疫治疗的免疫细胞的方法， 包括将构成所述多链CAR的多肽引入到所述免疫细胞并扩增所述细胞。在【具体实施方式】 中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供细胞和在如上所描述的细胞表面表达至 少一种多链CAR。在【具体实施方式】中，该方法包括用至少一种多核苷酸转化细胞，该多核苷 酸编码构成如上所描述的至少一个多链CAR的多肽，并且将所述多核苷酸表达进入所述细 胞。
[0109] 在另一个实施方式中，本发明涉及制备用于免疫治疗的细胞的方法，包括将构成 所述多链CAR的不同多肽引入进入所述细胞并扩增所述细胞。在优选的实施方式中，所述 多核苷酸包括在考虑到在细胞中稳定表达的慢病毒载体中。
[0110] 在另一个实施方式中，所述方法进一步包括通过以下遗传修饰所述细胞的步骤： 失活表达TCR的一种成分的至少一个基因，对于免疫抑制剂的靶，HLA基因和/或免疫检 查点基因如⑶1或CTLA-4。在优选的实施方式中，所述基因选自由TCRa、TCR0、⑶52、 GR、PD1和CTLA-4组成的组。在优选的实施方式中，所述方法进一步包括将罕见切割核酸 内切酶引入到所述T细胞，该酶能够通过DNA切割选择性失活所述基因。在更优选的实施 方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识 别并且切割靶序列的那些酶，选自由以下组成的组：SEQ ID N0:1至6(GR)、SEQ ID N0:37、 57 至 60(TCRa )、SEQ ID N0:38 或 39(TCR0 )、和 SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:61 至 SEQ ID NO:65(CD52)、SEQ ID NO:74 至 SEQ ID NO:78(PD1 和 CTLA-4)。
[0111] 失活基因是指不以功能蛋白形式表达感兴趣的基因。在【具体实施方式】中，在提供 的待工程化的细胞中，该方法的遗传修饰依赖一种罕见切割核酸内切酶的表达使得所述罕 见切割核酸内切酶在一种靶基因中特异性催化切割从而失活所述靶基因。由罕见切割核酸 内切酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接（NHEJ)的不同机制修复。 然而，NHEJ是不完美的修复过程，其往往导致在切割位点处DNA序列的改变。机制涉及剩 下两个DNA末端通过直接再连接（Critchlow and Jackson 1998)或经由所谓微同源介导 的末端连接（Ma，Kim et al. 2003)的重连接。经由非同源末端连接（NHEJ)的修复通常引 起小插入或缺失并且可以用于创建特异性基因敲除。所述修饰可以是至少一个核苷酸的取 代、缺失或添加。可以由本领域中公知的方法识别和/或选择其中切割诱导的突变事件（即 连续到NHEJ事件的突变事件）已发生的细胞。
[0112] 在另一个实施方式中，可以将另外的催化结构域进一步引入到具有所述罕见切割 核酸内切酶的细胞以增加突变，以增强失活本公开中描述的靶基因的能力。特别是，所述 另外的催化结构域是DNA末端加工酶。DNA末端加工酶的非限制性实例包括5-3'核酸外 切酶、3-5'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶（flap endonucleases)、 解旋酶、磷酸酶（hosphatase)、水解酶和模板-不依赖的DNA聚合酶。此类催化结构域的 非限制性实例包括（comprise of)蛋白结构域或蛋白结构域的催化活性衍生物，其选自由 以下组成的组：hExol(EX01_HUMAN)、酵母 Exol(EX01_YEAST)、大肠杆菌（E. coli)Exol、人 类TREX2、小鼠TREX1、人类TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT (末端脱氧核苷酸基转移酶） 人类DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)。在优选的实施方式中，所述另外的催化结构域具有 3' _5' -核酸外切酶活性，并且在更优选的实施方式中，所述另外的催化结构域是TREX，更 优选TREX2催化结构域（W02012/058458)。在另一个优选的实施方式中，所述催化结构域由 单链TREX多肽编码。所述另外的催化结构域可以可选地由肽接头融合至根据本发明的核 酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。
[0113] 已知核酸内切断裂刺激同源重组的速率。因此，在另一个实施方式中，该方法的遗 传修饰步骤还包括将胞外源核酸引入细胞的步骤，至少包括与靶核酸序列的部分同源的序 列，使得在靶核酸序列和外源核酸之间发生同源重组。在【具体实施方式】中，所述外源核酸包 括其分别与靶核酸序列的5'和3'区域同源的第一和第二部分。在这些实施方式中的所述 外源核酸还包括位于第一和第二部分之间的第三部分，其包括与靶核酸序列的5'和3'区 域的不同源性。切割靶核酸序列之后，在靶核酸序列和外源核酸之间刺激同源重组事件。优 选地，在所述供体基质内使用至少50bp、优选超过100bp并且更优选超过200bp的同源序 列。因此，外源核酸优选为从200bp至6000bp、更优选从lOOObp至2000bp。实际上，共享 的核酸同源性位于侧接上游和下游的区域中，断裂位点和待引入的核酸序列应位于两臂之 间。
[0114] 特别是，所述外源核酸依次包括与所述切割的上游序列同源的第一区域、失活选 自由以下组成的组的一个靶基因的序列：TCR a、TCRf3、⑶52、GR、免疫检查点基因，和与切 割的下游序列同源的第二区域。可以在引入或表达所述罕见切割核酸内切酶的同时、之前 或之后进行所述多核苷酸引入步骤。取决于其中已发生断裂事件的靶核酸序列的位置，此 类外源核酸可以用于敲除基因，例如当外源核酸位于所述基因的开放阅读框内时，或用于 引入新的序列或感兴趣的基因。通过使用此类外源核酸的序列插入，通过校正或取代所述 基因（等位基因交换作为非限制性实例）可以用于修饰靶向的现有基因，或用于上调或下 调靶基因的表达（启动子交换作为非限制性实例），所述靶基因校正或取代。在优选的实施 方式中，可以在由特异性TALE核酸酶靶向的精确的基因组位置处进行失活来自由TCR a、 TCR0、⑶52、GR、免疫检查点基因组成的组的基因，其中所述特异性TALE核酸酶催化切割 并且其中所述外源核酸依次包括至少同源性的区域和序列以失活一个靶基因，靶基因选自 由TCRa、TCRf3、⑶52、GR、免疫检查点基因组成的组，其通过同源重组整合。在另一个实施 方式中，可以依次地或同时地通过分别使用几种TALE核酸酶并且特异性靶向一种限定的 基因和用于特异性基因失活的几种特异性多核苷酸失活几种基因。
[0115] 另外的基因组修饰步骤也可指选自由TCRa、TCR0、⑶52、GR、免疫检查点基因组 成的组的另一种基因的失活。如上所描述的，所述另外的基因组修饰步骤可以是包括以下 的失活步骤：
[0116] (a)将至少一种罕见切割核酸内切酶引入到所述细胞使得所述罕见切割核酸内切 酶特异性地催化在所述细胞的基因组的一个靶序列中的切割。
[0117] (b)将外源核酸可选地引入到所述细胞，外源核酸依次包括与所述切割的上游序 列同源的第一区域，待插入所述细胞的基因组中的序列，和与所述切割的下游序列同源的 第二区域，
[0118] 其中所述引入的外源核酸失活基因并整合编码至少一种感兴趣的重组蛋白的至 少一个外源多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述外源多核苷酸序列被整合在选自由 TCRa、TCR0、⑶52、GR、免疫检查点基因组成的组的基因内。
[0119] _免疫抑制抗性T细胞：
[0120] 在具体的方面，遗传修饰细胞的步骤之一可以是包括以下的方法：
[0121] (a)通过失活表达用于免疫抑制剂的靶的至少一个基因修饰T细胞，和
[0122] (b)可选地在所述免疫抑制剂的存在下扩增所述细胞。
[0123] 免疫抑制剂是由作用的几种机制之一抑制免疫功能的药剂。换言之，免疫抑制剂 通过化合物起作用，其通过减弱免疫应答的程度和/或幅度（voracity)的能力表现。作为 非限制性实例，免疫抑制剂可以是钙调磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶、白介素-2 a _链阻断 剂、肌苷单磷酸脱氢酶的抑制剂、二氢叶酸还原酶的抑制剂、皮质类固醇或免疫抑制抗代谢 物。传统的细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成起作用。其他可以通过活化T细胞或通 过抑制辅助细胞的活化起作用。通过失活T细胞中的免疫抑制剂的靶，根据本发明的方法 允许赋予对用于免疫治疗的T细胞的免疫抑制抗性。作为非限制性实例，用于免疫抑制剂 的靶可以是用于免疫抑制剂的受体，如：CD52、糖皮质激素受体（GR)、FKBP家族基因成员和 亲环素家族基因成员。
[0124] 失活基因是指不以功能蛋白形式表达感兴趣的基因。在【具体实施方式】中，在提供 的待工程化的细胞中，该方法的遗传修饰依赖一种罕见切割核酸内切酶的表达，使得所述 罕见切割核酸内切酶特异性催化在一种靶基因中的切割，从而失活所述靶基因。在具体实 施方式中，所述要工程化细胞的方法包括以下步骤中的至少一个：
[0125] (a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；
[0126] (b)在表达用于免疫抑制剂的靶的所述T细胞中选择基因；
[0127] (c)将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该罕见切割核酸内切酶能够通过 DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码所述免疫抑制剂的靶的所述基因，和
[0128] (d)可选地在所述免疫抑制剂的存在下扩增所述细胞。
[0129] 在更优选的实施方式中，所述方法包括：
[0130] (a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；
[0131] (b)在所述表达用于免疫抑制剂的靶的T细胞中选择基因；
[0132] (c)用编码罕见切割核酸内切酶的核酸的转化所述T细胞，该罕见切割核酸内切 酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码所述免疫抑制剂的靶的所述基 因，和
[0133] (d)将所述罕见切割核酸内切酶表达进入所述T细胞；
[0134] (e)可选地在所述免疫抑制剂的存在下扩增所述细胞。
[0135] 在【具体实施方式】中，所述罕见切割核酸内切酶特异性靶向选自由CD52、GR组成的 组的一种基因。在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤（b)的所述基因是 CD52并且步骤（d)或（e)的免疫抑制性治疗包括人源化抗体靶向CD52抗原。
[0136] 在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤（b)的所述基因是糖皮质 激素受体（GR)并且步骤（d)或（e)的免疫抑制性治疗包括皮质类固醇如地塞米松。
[0137] 在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤（b)的所述靶基因是FKBP 家族基因成员或其变体并且步骤（d)或（e)的免疫抑制性治疗包括FK506,也称为他克莫司 或藤霉素。在另一个实施方式中，所述FKBP家族基因成员是FKBP12或其变体。
[0138] 在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤（b)的所述基因是亲环素 家族基因成员或其变体并且步骤（d)或（e)的免疫抑制性治疗包括环孢素。
[0139] 在另一个实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶 (meganuclease)、锌指核酸酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内 切酶是TALE核酸酶。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识别和切割选自由以下组成的组 的靶序列的那些：
[0140] -SEQ ID N0:1 至 6 (GR)，和
[0141] -SEQ ID N0:40、61 至 65(CD52)。
[0142] 所述TALE核酸酶优选包括选自SEQ ID NO: 7至SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:47 至SEQ ID N0:48的多肽序列，以切割各自的靶序列SEQ ID N0:1至6和SEQ ID N0:40。
[0143]-用于免疫治疗的高活性T细胞
[0144] 在具体的方面，遗传修饰细胞的一个具体步骤可以是包括以下的方法：
[0145] (a)通过失活至少一种免疫检查点基因修饰T细胞；和
[0146] (b)扩增所述细胞。
[0147] T细胞介导的免疫包括多个顺序步骤，涉及抗原特异性细胞的克隆选择、它们在 次级淋巴组织中的活化和增殖、它们转运（traffick)至抗原和炎症位点、直接效应子功能 的执行和对于大量效应子免疫细胞提供帮助（通过细胞因子和膜配体）。通过使微调应 答的刺激和抑制信号平衡来调节这些步骤中的每个。本领域普通技术人员将理解，术语 "免疫检查点"是指由T细胞表达的一组分子。这些分子有效地作为"制动器"以下调或抑 制免疫应答。免疫检查点分子包括，但不限于程序性死亡1 (Programmed Death 1)(PD_1， 也称为⑶1或⑶279,登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4,也称为 CD152, GenBank 登录号 AF414120. 1)、LAG3 (也称为 CD223,登录号：NM_002286. 5)、Tim3 (也 称为 HAVCR2, GenBank 登录号：JX049979. 1)、BTLA(也称为 CD272,登录号：NM_181780. 3)、 BY55(也称为 CD160, GenBank 登录号：CR541888. 1)、TIGIT(也称为 VSTM3,登录号： NM_173799)、B7H5(也称为C10或f54,小鼠远景基因（vista gene)的同源物，登录号： NM_022153. 1)、LAIR1(也称为 CD305, GenBank 登录号：CR542051. 1)、SIGLEC10 (GenBank 登 录号：AY358337. 1)、2B4(也称为CD244,登录号：NM_001166664. 1)，其直接抑制免疫细胞。 例如，CTLA-4是在某些⑶4和⑶8T细胞上表达的细胞表面蛋白；当通过它在抗原呈递细胞 上的配体（B7-1和B7-2)连接时，T细胞活化和效应子功能受到抑制。因此，本发明涉及工 程化特别是用于免疫治疗的T细胞的方法，包括通过失活参与免疫检查点至少一种蛋白、 具体是PD1和/或CTLA-4来遗传修饰T细胞。
[0148] 在【具体实施方式】中，所述工程化细胞的方法包括以下步骤中的至少一个：
[0149] (a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；
[0150] (b)将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割、 优选通过双链断裂选择性失活编码免疫检查点蛋白的一种基因；
[0151] (c)扩增所述细胞。
[0152] 在更优选的实施方式中，所述方法包括：
[0153] (a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；
[0154] (b)用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转化所述T细胞，该核酸内切酶能够通过 DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码免疫检查点蛋白的基因；
[0155] (c)将所述罕见切割核酸内切酶表达进入所述T细胞；
[0156] (d)扩增所述细胞。
[0157] 在【具体实