[0218] 在另一个实施方式中，根据本发明，通过失活TCRa基因和/或TCR0基因，使TCR 在细胞中不呈现功能。以上策略更具体地用于避免GvHD。在本发明的具体的方面，是获得 源自个体的修饰细胞的方法，其中所述细胞可以不依赖于主要组织相容性复合体信号转导 通路增殖。所述方法包括以下步骤：
[0219] (a)从所述个体回收细胞；
[0220] (b)通过失活TCRa或TCR0基因离体遗传修饰所述细胞；
[0221] (c)在扩增所述细胞的适当条件下体外培养遗传修饰的T细胞。
[0222] 通过该方法易于获得的修饰的细胞，其可以不依赖于主要组织相容性复合体信号 转导通路增殖，包括在本发明的范围内。可以在本发明的具体的方面中使用所述修饰细胞 用于治疗需要其对抗宿主抗移植物（HvG)排斥反应和移植物抗宿主病（GvHD)的患者；因 此，在本发明的范围内，是治疗需要其对抗宿主抗移植物（HvG)排斥反应和移植物抗宿主 病（GvHD)的患者的方法，包括通过将有效量的修饰的细胞给予所述患者治疗所述患者，该 修饰的细胞包括失活的TCR a和/或TCR 0基因。
[0223] T细朐的活化和扩增
[0224] 不论在T细胞的遗传修饰之前还是之后，通常使用如下列文献中所描述的方法 可以活化并扩增T细胞，例如，美国专利6352694 ;6534055 ;6905680 ;6692964 ;5858358 ; 6887466 ；6905681 ；7144575 ；7067318 ；7172869 ；7232566 ；7175843 ；5883223 ；6905874 ； 6797514 ;6867041 ;和美国专利申请公开号20060121005。可以在体外或体内扩增T细胞。
[0225] 通常，通过与刺激T细胞表面上的⑶3TCR复合体和共刺激分子以创建用于T细胞 的活化信号的试剂接触扩增本发明的T细胞。
[0226] 例如，化学物质如钙离子载体A23187,佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA)或 促有丝分裂外源凝集素样植物凝集素（PHA)可以用于创建用于T细胞的活化信号。
[0227] 作为非限制性实例，如通过接触抗CD3抗体、或其抗原结合片段、或固定在表面上 的抗CD2抗体，或通过接触结合钙离子载体的蛋白激酶C活化剂（例如，苔藓抑素），可以在 体外刺激T细胞群体。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。 例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞的群体可以接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。 为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供每个信号 的试剂可以在溶液中或结合至表面。如本领域普通技术人员可容易地理解的，颗粒对细胞 的比率可以取决于相对于靶细胞的粒径。在本发明的进一步实施方式中，细胞如T细胞与 试剂涂覆的珠结合，该珠和细胞被随后分离，然后将细胞进行培养。在可替代实施方式中， 在培养之前，试剂涂覆的珠和细胞不分离而是一起培养。适于T细胞培养的条件包括合适 的培养基（例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5,（Lonza))，其可以包括 用于增殖和生存力必需的因素，包括血清（例如，胎牛血清或人类血清）、白介素-2 (IL-2)、 胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、lL-15、TGFp、和 TNF-或本领域技术人员已知用 于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括，但不限于，表面活性剂、 血浆蛋白和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、 A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1 和 X-Vivo 20,优化剂（Optimizer)，添加有氨基 酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清（或血浆）或定义设置的激素，和/ 或足够用于生长和扩增T细胞的量的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验 培养物中，不在要注入到受试者的细胞培养物中。在支持生长必需的条件下，例如适当的温 度（例如37°C )和大气（例如，空气加5% C02)，靶细胞得到维持。已暴露于不同刺激时间 的T细胞可显示出不同的特性。
[0228] 在另一个【具体实施方式】中，可以通过用组织或细胞共培养扩增所述细胞。在所述 细胞给予至受试者之后，所述细胞还可以在体内、例如在受试者的血液中扩增。
[0229] 治疗应用
[0230] 在另一个实施方式中，由不同方法获得的分离的细胞或源自如前所描述的所述的 分离的细胞的细胞系可以用作药物。在另一个实施方式中，所述药物可以用于治疗需要其 的患者中的癌症或感染。在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞或源自所述 分离的细胞的细胞系可以在制备用于治疗需要其的患者中的癌症、病毒感染或自身免疫疾 病的药物中使用。
[0231] 在另一方面，本发明依赖于用于治疗需要其的患者的方法，所述方法包括以下步 骤中的至少一个：
[0232] (a)提供通过前述方法中的任何一种可获得的免疫细胞；
[0233] (b)向所述患者给予所述转化的免疫细胞，
[0234] 在一个实施方式中，本发明的所述T细胞可以经历体内健壮（robust)的T细胞扩 增并可持续用于时间的延长量。
[0235] 所述治疗可以是改善、治愈或预防的。它可以是自体免疫治疗的部分或同种异体 免疫治疗的部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群源自所述患者或人类白 细胞抗原（HLA)相容供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞群不源自所述患者但 源自供体。
[0236] 本发明特别适用于同种异体免疫治疗，在它能够转化T细胞的范围内，通常从供 体获得，到非同种反应性细胞中。这可根据标准方案完成，并根据需要再生多次。所产生的 修饰的T细胞可以汇集并给予至一个或几个患者，使可以用作"现成的"治疗产品。
[0237] 在上一节中描述了可以与公开的方法一起使用的细胞。所述治疗可以用于治疗诊 断患有癌症、病毒感染、自身免疫疾病或移植物抗宿主病（GvHD)的患者。可以被治疗的癌 症包括未血管化的、或尚未基本上血管化的、以及是血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤 (如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤），或可以包括实体瘤。待用本发明的多链CAR治疗 的癌症类型包括，但不限于，癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和 恶性肿瘤，和恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在 内。
[0238] 它可以是结合对抗癌症的一种或多种疗法的治疗，其选自抗体疗法、化学疗法、细 胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法的组。
[0239] 根据本发明的优选的实施方式，所述治疗可给予至接受免疫抑制性治疗的患者。 实际上，本发明优选依赖于细胞或细胞的群体，由于编码此类免疫抑制剂的受体的基因失 活，其已经耐受至少一种免疫抑制剂。在这方面，免疫抑制性治疗应有助于患者内的根据本 发明的T细胞的选择和扩增。
[0240] 根据本发明，可以任何方便的方式进行细胞或细胞的群体的给予，包括通过雾化 吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。可以皮下地、皮内地、瘤内地、结内地、髓内地、肌内地、 通过静脉内或淋巴内注射、或腹腔内地将本文描述的组合物给予至患者。在一个实施方式 中，优选通过静脉内注射给予本发明的细胞组合物。
[0241] 细胞或细胞的群体的给予可以由104_109细胞/kg体重，优选10 5至10 6细胞/kg 体重的给予组成，其包括那些范围内的细胞数的所有整数值。可以一个或多个剂量给予细 胞或细胞的群体。在另一个实施方式中，以单剂量给予所述有效量的细胞。在另一个实施 方式中，跨越一段时间以多于一个剂量给予所述有效量的细胞。给予的时间在管理医师的 判断范围内并且取决于患者的临床情况。细胞或细胞的群体可以获自任何来源，如血库或 供体。当个体需要变化时，确定用于具体疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围 在本领域的技术范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受 者的年龄、健康和体重、并行治疗的种类（如果有的话）、治疗的频率和所需效果的性质。
[0242] 在另一个实施方式中，肠胃外给予所述有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。 所述给予可以是静脉内给予。所述给予可以通过肿瘤内注射直接完成。
[0243] 在本发明的某些实施方式中，结合（例如，之前、同时或之后）任何数量的相关 治疗方式将细胞给予至患者，包括但不限于用试剂治疗，如抗病毒疗法，用于MS患者的 西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷（也称为ARA-C)或那他珠单抗（nataliziimab)治疗， 或用于牛皮癣患者的efaliztimab治疗或用于PML患者的其他治疗。在进一步实施方 式中，本发明的T细胞可结合下列项使用：化学疗法，放射，免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑 嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506,抗体或其他免疫清除剂如CAM PATH、抗CD3抗体或 其他抗体疗法，细胞毒素（cytoxin)，氟达拉滨（fludaribine)，环孢菌素，FK506,雷帕 霉素，霉酚酸（mycoplienolic acid)，类固醇，FR901228,细胞因子和照射。这些药物抑 制钙依赖磷酸酶钙调磷酸酶（环孢霉素和FK506)或抑制p70S6激酶，其对于生长因子 诱导的信号转导（雷帕霉素）重要（Liu et al.，Cell 66:807-815, 11 ;Henderson et al. , Immun. 73:316-321, 1991 ；Bierer et al. , Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93) 〇 在进一 步实施方式中，本发明的细胞组合物被给予至患者，结合（例如，之前，同时或之后）骨髓 移植，T细胞消融疗法，使用化学疗法药剂如氟达拉滨，外部束辐射治疗（XRT)，环磷酰胺 (cyclophosphamide)，或抗体如0KT3或CAMPATH，在另一个实施方式中，本发明的细胞组合 物在B细胞消融疗法后给予，如与CD20反应的试剂例如利妥昔单抗。例如，在一个实施方 式中，受试者可以经历用高剂量化学疗法的标准治疗然后是外周血干细胞移植。在某些实 施方式中，跟随移植，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方式中， 在外科手术之前或之后给予扩增的细胞。可以在本发明的具体的方面使用通过任何一种本 文所描述的方法获得的所述修饰的细胞，用于治疗需要其对抗宿主抗移植物（HvG)排斥反 应和移植物抗宿主病（GvHD)的患者；因此，在本发明的范围内的是治疗需要其对抗宿主抗 移植物（HvG)排斥反应和移植物抗宿主病（GvHD)的患者的方法，包括通过将有效量的修饰 的细胞给予所述患者治疗所述患者，修饰的细胞包含失活的TCRa和/或TCR0基因。
[0244] 工稈化用于免痔治疗的人类同种异体细朐的方法的实例
[0245] 为了更好地理解本发明，工程化用于免疫治疗的人类同种异体细胞的方法的一个 实例示于图5,该方法包括以下步骤中的一个或几个的组合：
[0246] 1.从细胞培养物或从来自一个个体患者的血液样品或从血库提供T细胞并且使 用抗CD3/C28活化剂珠活化所述T细胞。该珠提供用于T细胞活化和扩增所需的初级和共 刺激信号。
[0247] 2.a)用pTa或其功能性变体的转基因转导所述细胞以支持⑶3表面表达，并通 过刺激CD3复合体允许细胞扩增。预期TCR破坏消除TCR复合体，并移除同种异体反应 (GvHD)，但由于CD3信号转导组分的损失可能改变同种异体细胞扩增。预期转导的细胞表 达pTa链或其功能性变体。该pTa链与TCR0链和⑶3信号转导组分配对以形成前TCR 复合体并因此修复功能性CD3复合体并支持失活的TCRa细胞的活化或刺激。可以在TCRa 失活之前或之后实现用pTa慢病毒载体转导T细胞。
[0248] b)用多链CAR转导所述细胞允许将T细胞重定向针对在来自包括淋巴瘤和实体瘤 在内的各种恶性肿瘤的靶细胞表面表达的抗原。为了改善共刺激结构域的功能，本发明人 已设计了源自如前所述FceRI的多链CAR。可以在TCRa和其他基因如⑶52基因的失活 之前或之后完成转导。
[0249] 3.工程化非同种反应性和免疫抑制抗性T细胞：
[0250]a)可能的是失活所述细胞中的TCRa以从细胞表面消除TCR，并且防止由同种异 体的TCR将宿主组织识别为外源的组织，从而避免GvHD。
[0251]b)还可能的是失活编码免疫抑制剂的靶的一种基因以使所述细胞抗免疫抑制性 治疗以防止移植排斥反应而不影响移植的T细胞。在这个实例中，免疫抑制剂的靶是CD52 并且免疫抑制剂是人源化单克隆抗CD52抗体。
[0252] 已由本发明人示出，通过允许T细胞内较高比率的DSB事件，TALE核酸酶的使用 特别有利于实现T细胞中的上述双失活。优选地，通过用编码靶向所述基因的TALE核酸酶 的mRNA电穿孔T细胞失活TCRa和CD52基因。已由本发明人发现，使用导致高转化率的 mRNA对T细胞危害较小，因此在工程化T细胞的方法中是至关重要的。然后，使用磁性珠分 选失活的T细胞。例如，由固体表面上的固定移除表达CD52的T细胞并且失活的细胞不暴 露通过柱的应力。这种温和的方法增加适当工程化T细胞的浓度。
[0253] 4.在给予至患者之前体外扩增工程化的T细胞，或在给予至患者之后通过刺激 CD3复合体体内扩增工程化的T细胞。在给予步骤之前，患者可经受免疫抑制性治疗如 CAMPATH1-H，其是人源化单克隆抗体抗⑶52。
[0254] 5.在给予至患者之前，可选地用双特异性抗体离体暴露所述细胞，或在给予至患 者之后体内地促使工程化的细胞接近靶抗原。
[0255] 其他宙义
[0256] _除非另有规定，"一个（a) "，"一种（an) "，"该（the) "和"至少一个"可互换使用 并且是指一个或一个以上。_在本文中根据单字母代码指定多肽序列中的氨基酸残基，其中 例如Q是指Gin或谷氨酰胺残基，R是指Arg或精氨酸残基，D是指Asp或天冬氨酸残基。
[0257]-氨基酸替换是指用另一个氨基酸残基替换一个氨基酸残基，例如，在肽序列中用 谷氨酰胺残基替换精氨酸残基是氨基酸替换。
[0258]-如下指定核苷酸：单字母代码用于指定核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶， c是胞喃啶，g是鸟嗓呤。对于简并核苷酸，r代表g或a(嗓呤核苷酸），k代表g或t，s代 表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y表示t或c(喃啶核苷酸），d代表g、a或t，v代表 g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c并且n代表g、a、t或c〇
[0259]-如本文所用，"核酸"或"多核苷酸"是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核 酸（DNA)或核糖核酸（RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应（PCR)产生的片段，和通过任何 连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可由单体构成，其是 天然存在的核苷酸（如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物（例如，天然存在的核苷 酸的对映体形式）或两者的组合。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或嘌呤碱基部 分具有改变。糖修饰包括例如用以下取代一个或多个羟基基团：卤素、烷基基团、胺和叠氮 基团，或糖可以被官能化为醚或酯。此外，可以用空间地和电子地相似的结构取代整个糖部 分，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶，酰化的 嘌呤或嘧啶，或其他公知的杂环取代。可以通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接核酸单 体。核酸可以是单链或双链的。
[0260] 连续包括与所述双链断裂的上游序列同源的第一区域、待插入所述细胞基因组 中的序列，和与所述双链断裂的下游序列同源的第二区域的多核苷酸"是指这样的DNA构建 体或基质，其包括与原位DNA靶的区域5'和3'同源的第一和第二部分。DNA构建体还包括 位于第一和第二部分之间的第三部分，其包括与相应的原位DNA序列的部分同源性，或可 替代地包括与原位DNA靶的区域5'和3'无同源性。切割DNA靶以后，在包含包括在感兴 趣基因座的基因组和该基质之间刺激同源重组事件，其中由基质的第三部分和所述基质的 第一和第二部分的可变部分取代包含DNA靶的基因组序列。
[0261] -"DNA靶"，"DNA靶序列"，"靶DNA序列"，"核酸靶序列"，"靶序列"或"处理位点" 是指可以由根据本发明的罕见切割核酸内切酶靶向和加工的多核苷酸序列。这些术语是指 具体的DNA位置，优选细胞中的基因组位置，同样还有可独立地于遗传物质的主体存在的 遗传物质部分，作为非限制性实例，如质粒、附加体、病毒、转座子，或在细胞器如线粒体中。 作为TALE核酸酶的靶的非限制性实例，靶基因组序列一般由以下组成：由15-bp间隔子分 隔的两个17-bp长的序列（称为半靶）。作为非限制性实例，每个半靶由列于表1、5、6和 10中的TALE核酸酶的重复识别，其在EFl-a启动子或17启动子的控制下编码在质粒中。 由所述靶的一条链的5'至3'序列限定核酸靶序列，如表1，5,6和10所示。
[0262] _嵌合抗原受体（CAR)是指这样的分子，其组合针对存在于靶细胞上的组分的结 合结构域，例如，对于具有T细胞受体活化胞内结构域的所期望抗原（例如，肿瘤抗原）的 基于抗体特异性以产生嵌合蛋白，其表现出特异性抗靶细胞免疫活性。通常，CAR由融合至 T细胞抗原受体复合物（链（scFvFc: 〇的胞内信号域的胞外单链抗体（scFvFc)组成，并 且当在T细胞中表达时，具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别的能力。本发明中 使用的CAR的一个实例是针对CD19抗原的CAR并且可以包括作为非限制性实例的氨基酸 序列：SEQIDN0:73。
[0263]- "递送载体（deliveryvector) " 或"多个递送载体（deliveryvectors) " 是指 任何递送载体，其可以在本发明中用于投入细胞接触（即"接触"）或递送到本发明中需要 的细胞或亚细胞区室（即"引入"）试剂/化学物质和分子（蛋白或核酸）内。它包括但不 限于脂质体递送载体，病毒递送载体，药物递送载体；化学媒介物（carrier)，聚合物媒介 物，脂质复合物，多聚复合物（polyplexes)，树枝状聚合物，微泡（超声造影剂），纳米颗粒， 乳剂或其他适当的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学物质、大分子（基因，蛋白） 或其他载体如质粒、由Diatos开发的肽。在这些情况下，递送载体是分子媒介物。"递送载 体"或"多个递送载体"也是指进行转染的递送方法。
[0264]-术语"载体（vector) "或"多个载体（vectors) "是指能够将另一个核酸转运到 其已连接它的核酸分子。本发明中的"载体"包括但不限于病毒载体，质粒，RNA载体或线性 或环状DNA或RNA分子，其可以由染色体的、非染色体的、半合成或合成的核酸组成。优选 的载体是能够自主复制（附加型载体）和/或表达它们与其连接的核酸（表达载体）的那 些。大量的合适载体是本领域技术人员已知的并且是可商购获得的。
[0265]-病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒（例如腺相关病毒）、冠状病毒、负 链RNA病毒如正粘病毒（例如，流感病毒）、弹状病毒（例如，狂犬病和水泡性口炎病毒）、 副粘病毒（例如麻瘆和仙台病毒）、正链RNA病毒如小核糖核酸病毒和甲病毒，以及双链 DNA病毒，其包括腺病毒、疱瘆病毒（例如，单纯疱瘆病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔二 氏（Epstein-Barr)病毒、巨细胞病毒），和痘病毒（例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘）。其他 病毒包括例如诺沃克病毒（Norwalkvirus)、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、 嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病 毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒（Coffin,J.M.，Retroviridae:Theviruses andtheirreplication,InFundamentalVirology,ThirdEdition,B.N.Fields,et al.，Eds.，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia, 1996)〇
[0266] _ "慢病毒载体"是指基于HIV的慢病毒载体，由于它们相对大的包装能力、降低 的免疫原性和它们以高效率稳定地转导大范围的不同细胞类型的能力，其对于基因递送非 常有前途。慢病毒载体通常在将三种（包装、包膜和转移）或多种质粒瞬时转染到生产细 胞之后产生。像HIV那样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体相互作用 进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录产物是 双链线性病毒DNA，其是用于感染的细胞的DNA中的病毒整合的底物。"整合型慢病毒载体 (或LV) "是指作为非限制性实例的此类载体，其能够整合靶细胞的基因组。相对地，"非整 合型慢病毒载体（或NILV) "是指有效的基因递送载体，其不通过病毒整合酶的作用整合靶 细胞的基因组。
[0267]-递送载体和载体可以与任何细胞透化技术如声孔效应或电穿孔或这些技术的衍 生物相关联或组合。
[0268]-细胞（cell)或多个细胞（cells)是指源自用于体外培养的这些生物体的任何真 核活细胞、原代细胞