施方式】中，所述罕见切割核酸内切酶特异性靶向选自由以下组成的组 的一种基因：PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、 TCRa和TCR0。在另一个实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶、 锌指核酸酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核 酸酶。TALE核酸酶是指由源自转录活化子样效应子（Transcription Activator Like Effector) (TALE)的DNA结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成以切割核酸靶序列的融 合蛋白。（Boch，Scholze et al.2009;Moscou and Bogdanove 2009;Christian，Cermak et al. 2010 ；Cermak, Doyle et al. 2011 ；Geissler, Scholze et al. 2011 ；Huang, Xiao et al.2011 ；Li, Huang et al. 2011 ；Mahfouz, Li et al.，2011 ;Miller，Tan et al. 2011 ； Morbitzer, Romer et al.2011 ；Mussolino, Morbitzer et al.2011 ；Sander,Cade et al.2011 ；Tesson, Usal et al.2011 ；Weber, Gruetzner et al.2011 ；Zhang, Cong et al.2011 ；Deng, Yan et al. 2012 ；Li, Piatek et al. 2012 ；Mahfouz, Li et al. 2012 ； Mak, Bradley et al. 2012) 〇
[0158] 在本发明中，已设计新的TALE核酸酶用于精确靶向用于继承性免疫治疗策略的 有关基因。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识别和切割选自由以下组成的组的靶序列 的那些 ：3￡〇10勵：77和5￡〇10勵：78(卩01)、5￡〇10勵：74至5￡〇10勵：76((：1'1^-4)。 本发明还涉及这样的TALE核酸酶多肽，其包括选自由SEQ ID N0:79至SEQ ID N0:88组成 的组的氨基酸序列。
[0159] 本发明还涉及包括这样的氨基酸序列的多肽，其具有与选自由SEQIDN0:79至 SEQIDN0:88组成的组的氨基酸序列至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、95%、 97%或99%的序列同一性。编码根据本发明的以上描述的罕见切割核酸内切酶多核苷酸、 载体也包括在本发明的范围内。该方法可与本公开中描述的任何一个不同方法相关。
[0160] _非同种反应性T细胞：
[0161] 在另一个实施方式中，本发明可特别适用于同种异体免疫治疗。在这种情况下，遗 传修饰细胞的步骤之一可以是包括以下的方法：
[0162] (a)通过失活编码T细胞受体（TCR)的组分的至少一种基因修饰T细胞；
[0163](b)扩增所述细胞。
[0164] 在【具体实施方式】中，在提供的待工程化的细胞中，该方法的遗传修饰依赖于一种 罕见切割核酸内切酶的表达，使得所述罕见切割核酸内切酶特异性催化在一种靶基因中的 切割从而失活所述靶基因。在【具体实施方式】中，所述工程化细胞的方法包括以下步骤中的 至少一个：
[0165] (a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；
[0166] (b)将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割、 优选通过双链断裂选择性失活编码T细胞受体（TCR)的组分的至少一种基因；
[0167] (c)扩增所述细胞。
[0168] 在更优选的实施方式中，所述方法包括：
[0169] (a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；
[0170] (b)用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转化所述T细胞，该核酸内切酶能够通过 DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码T细胞受体（TCR)的组分的至少一种基因；
[0171] (c)将所述罕见切割核酸内切酶表达进入所述T细胞；
[0172] (d)分选转化的T细胞，其不在它们的细胞表面上表达TCR;
[0173] (e)扩增所述细胞。
[0174] 在另一个实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸 酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。根据 本发明的优选的TALE核酸酶是识别和切割选自由以下组成的组的靶序列的那些：
[0175] -SEQIDN0:37、57至60(TCRa)，
[0176] -SEQ ID NO: 38 或 39(TCR0 )，
[0177] 所述TALE核酸酶优选包括选自SEQ ID NO: 41至SEQ ID NO: 48的多肽序列，以切 割各自的靶序列SEQ ID NO:37至39。
[0178]-前Ta
[0179] 在另一方面，遗传修饰细胞的另一个步骤可以是扩增TCR a缺陷的T细胞的方法， 包括将pT a (也称为前TCR a )或其功能性变体引入到所述T细胞和扩增所述细胞，可选地 通过刺激CD3复合体。在优选的实施方式中，该方法包括：
[0180] (a)用编码至少pTa的片段的核酸转化所述细胞以支持CD3表面表达；
[0181] (b)将所述pTa表达进入所述细胞；
[0182] (c)可选地通过刺激⑶3复合体扩增所述细胞。
[0183] 本发明还涉及制备用于免疫治疗的T细胞的方法，包括用于扩增T细胞的方法的 步骤。
[0184] 在【具体实施方式】中，可以随机地或否则通过同源重组引入pTa多核苷酸序列，特 别是，插入可以与TCRa基因的失活相关。
[0185] 根据本发明，使用pTa的不同功能性变体。肽的"功能性变体"是指与整个肽或其 片段基本上相似的分子。本发明的PTa或其功能性变体的"片段"是指该分子的任何子集， 即，更短的肽。优选pTa或功能性变体可以是全长pTa或C-末端截短的pTa版本。C-末 端截短的pTa缺乏C-末端的一个或多个残基。作为非限制性实例，C末端截短的pTa版 本缺乏来自蛋白（3￡0 10勵：107至5￡0 10勵：114)的〇末端的18、48、62、78、92、110或 114个残基。此外，可以通过在编码肽的DNA中的突变制备肽的氨基酸序列变体。此类功能 性变体包括例如从氨基酸序列内的残基的缺失，或氨基酸序列内的残基的插入或取代。也 可制作缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所期望的 活性，特别是功能性CD3复合体的修复。在优选的实施方式中，在如上所描述的不同的pT a 版本引入至少一个突变以实现二聚。作为非限制性实例，突变的残基可以是人类pTa蛋白 的至少财61?、0224、1(244、1?1024或1?1174，或在口了€[家族或同源成员上使用0^5了41^方法 的对齐位置。优选地，如上所描述的pT a或其变体包括突变的残基W46R(SEQ ID NO: 123) 或突变的残基D22A、K24A、R102A和R117A(SEQ ID N0:124)。在【具体实施方式】中，所述pTa 或变体也融合至信号转导结构域如CD28、0X40、IC0S、CD27、CD137(4-1BB)和CD8,作为非限 制性实例（SEQ ID NO: 115至SEQ ID NO: 120)。如上所描述的pT a或变体的胞外结构域可 以融合至TCRa蛋白的片段，特别是TCRa的跨膜和胞内结构域（SEQ ID N0:122)。pTa 变体也可以融合至TCRa的胞内结构域（SEQID N0:121)。
[0186] 在另一个实施方式中，所述pT a版本融合至胞外配体结合结构域并且更优选地， pT a或其功能性变体融合至单链抗体片段（scFV)，其包括由柔性接头连接的靶抗原特异 性单克隆抗体的轻链(X)和重链（V H)可变片段。作为非限制性实例，pT a或其功能性变 体的氨基酸序列选自由SEQ ID N0:107至SEQ ID N0:124组成的组。
[0187] 因为一些变异性可以起因于从其衍生这些多肽的基因组数据，并且还考虑到取代 存在于不显著损失活性（功能性变体）的这些多肽中的一些氨基酸的可能性，本发明包括 以上多肽的多肽变体，其与在本专利申请中所提供的序列共享至少70%、优选至少80%、 更优选至少90%、甚至更优选至少95%的同一*性。
[0188] 因此，本发明被吸引到包括这样的多肽序列的多肽，其具有与选自由SEQ ID NO: 107至SEQ ID NO: 124组成的组的氨基酸序列至少70%、优选至少80%、更优选至少 90%、95%、97%或99%的序列同一性。
[0189] TCRa缺陷型T细胞是指缺乏功能性TCRa链的表达的分离的T细胞。这可以通 过不同的方式实现，作为非限制性实例，通过工程化T细胞使得它在其细胞表面上不表达 任何功能性TCRa，或通过工程化T细胞使得它在其表面上产生非常少的功能性TCRa链， 或通过工程化T细胞以表达TCRa链的突变或截断形式。
[0190] TCRa缺陷型细胞无法再通过⑶3复合体进行扩增。因此，为了克服这个问题并 允许TCRa缺陷型细胞的增殖，将 PT a或其功能性变体引入到所述细胞，从而修复功能性 CD3复合体。在优选的实施方式中，该方法还包括将罕见切割核酸内切酶引入所述T细胞， 该核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活编码一种T细胞受体（TCR)组分的一种基因。 在【具体实施方式】中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。作为非限制性实例，TALE核 酸酶针对选自由SEQ ID N0:37和SEQ ID N0:57至60组成的组的TCRa的基因靶序列之 一。优选地，TALE核酸酶选自由SEQ ID N0:41和SEQ ID N0:42的组。
[0191] 以上描述的编码pTa的多肽、特别是功能性变体也包括在本发明中。在优选的 实施方式中，本发明涉及pT a或其功能性变体，其融合至信号转导结构域如CD28、0X40、 10^、0)137和0)8。更特别是，本发明涉及包括选自由5￡〇10勵：107至5￡〇10勵：124 组成的组的氨基酸序列的pT a功能性变体。以上描述的编码PT a的多核苷酸，载体或其 功能性变体也包括在本发明中。
[0192] 在本发明的范围内还包括通过所述方法易于获得的分离的细胞或细胞系。特别 是，通过将pT a或其功能性变体引入所述细胞以支持CD3表面表达获得所述分离的细胞或 细胞系。在优选的实施方式中，进一步通过失活TCRa基因来遗传修饰所述分离的细胞或 细胞系。该基因优选地通过至少一种罕见切割核酸内切酶失活。在优选的实施方式中，所 述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。
[0193] 在本发明的范围内还包括通过工程化细胞、特别是T细胞的所述方法易于获得的 分离的细胞或细胞系，其中选自由TCRa、TCRf3、⑶52、GR，免疫检查点基因组成的组的至少 一种基因已被失活。
[0194] -双特异性抗体
[0195] 根据进一步实施方式，可以用双特异性抗体进一步暴露通过如前所描述的不同方 法获得的工程化T细胞。所述T细胞可以在给予至患者之前离体地或在给予至患者之后体 内地暴露于双特异性抗体。所述双特异性抗体包括具有不同抗原特性的两个可变区，其允 许促使工程化细胞接近靶抗原。作为非限制性实例，所述双特异性抗体针对肿瘤标志物和 淋巴细胞抗原如CD3并且具有重定向和活化任何循环T细胞对抗肿瘤的潜力。
[0196] 涕送方法
[0197] 以上描述的不同方法涉及将多链CAR、pT a或其功能性变体、罕见切割核酸内切 酶、TALE核酸酶、可选地具有DNA末端加工酶的CAR或外源核酸引入到细胞。
[0198] 作为非限制性实例，可以引入所述多链CAR、pT a或其功能性变体、罕见切割核酸 内切酶、TALE核酸酶或可选地具有DNA末端加工酶的CAR或外源核酸作为由一种或不同 质粒载体编码的转基因。不同的转基因可以包括在一种载体中，其包括编码核糖体跳读序 列的核酸序列如编码2A肽的序列。2A肽，其在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚组中被识 另IJ，引起从一个密码子到下一个密码子的核糖体"跳读"而不形成由密码子所编码的两个氨 基酸之间的肽键（参见 Donnelly et al.，J. of General Virology 82:1013-1025(2001); Donnelly et al. , J. of Gen. Virology 78:13-21 (1997) ；Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28 (13): 4227-4239 (2008) ;Atkins et al.,RNA 13:803-810 (2007))。"密码子"是 指在mRNA上（或在DNA分子的有义链上）的3个核苷酸，其由核糖体翻译成一个氨基酸残 基。因此，当多肽由在框中的2A寡肽序列分离时，可从在mRNA内的单个、连续的开放阅读 框合成两个多肽。此类核糖体跳读机制是本领域中公知的并且已知被用于表达由单个信使 RNA所编码的几种蛋白的几个载体使用。作为非限制性实例，在本发明中，2A肽已用于将罕 见切割核酸内切酶和DNA末端加工酶或多链CAR的不同多肽表达进入细胞。
[0199] 所述质粒载体还可以包括选择标志物，其提供对接受所述载体的细胞的识别和/ 或选择。
[0200] 作为将编码所述多肽的多核苷酸引入到细胞内结果，可以在细胞中原位合成多 肽。可替代地，多肽可以在胞外产生所述，然后将其引入其中。用于将多核苷酸构建体引入 到动物细胞的方法是本领域中已知的并且作为非限制性实例包括其中将多核苷酸构建体 整合到细胞的基因组中的稳定转化方法、其中多核苷酸构建体不整合到细胞的基因组中的 瞬时转化方法和病毒介导的方法。通过例如重组病毒载体（例如逆转录病毒，腺病毒）、脂 质体等，可以将所述多核苷酸引入到细胞。例如，瞬时转化方法包括例如显微注射、电穿孔 或粒子轰击。考虑到在细胞中表达，所述多核苷酸可以包括在载体、更具体是质粒或病毒 中。
[0201] _电穿孔
[0202] 在本发明的【具体实施方式】中，根据本发明的编码多肽的多核苷酸可以是例如通过 电穿孔将其直接引入到细胞中的mRNA。本发明人确定在T细胞中用于mRNA电穿孔的最佳 条件。
[0203] 本发明人使用cytoPulse技术，其通过使用脉冲电场允许瞬时透化活细胞用于 递送材料进入细胞。基于使用PulseAgile(Cellectis产权）电穿孔波形，该技术授予对 脉冲持续时间、强度以及脉冲之间间隔的精确控制（美国专利6010613和国际PCT申请 W02004083379)。可以修饰所有这些参数以达到对于具有最小死亡率的高转染效率的最佳 条件。基本上，第一高电场脉冲允许孔形成，同时后续的较低电场脉冲允许将多核苷酸移动 进入细胞。在本发明的一个方面中，发明人描述引起实现mRNA在T细胞中的>95%转染效 率，并且使用电穿孔方案以在T细胞中瞬时表达不同种类的蛋白的步骤。特别是，本发明涉 及转化T细胞的方法，包括使所述T细胞与RNA接触和向T细胞施加敏捷脉冲序列，由以下 组成：
[0204] (a) -个具有电压范围从2250至3000V/厘米的电脉冲，在步骤（a)和（b)的电脉 冲之间，脉冲宽度为0. lms并且脉冲间隔为0. 2至10ms ;
[0205] (b) -个具有电压范围从2250至3000V的电脉冲，在步骤（b)的电脉冲和步骤（c) 的第一电脉冲之间，具有脉冲宽度为l〇〇ms并且脉冲间隔为100ms;和
[0206] (c) 4个具有电压为325V的电脉冲，在4个电脉冲的每个之间，具有脉冲宽度为 0. 2ms并且脉冲间隔为2ms。
[0207] 在【具体实施方式】中，转化T细胞的方法包括接触具有RNA的所述T细胞和向T细 胞施加敏捷脉冲序列，其包括：
[0208] (a) -个具有电压为 2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、 2600、2700、2800、2900或3000￥/厘米的电脉冲，在步骤（ &)和〇3)的电脉冲之间，脉冲宽度 为 0? lms 并且脉冲间隔为 0? 2、0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10ms;
[0209] (b) -个具有电压范围从 2250、为 2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、 2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲，在步骤（b)的电脉冲和步骤（c)的第 一电脉冲之间，具有脉冲宽度为l〇〇ms并且脉冲间隔为100ms;和
[0210] (c) 4个具有电压为325V的电脉冲，在4种电脉冲的每个之间具有脉冲宽度为 0. 2ms并且脉冲间隔为2ms。
[0211] 在本申请中公开包括在以上描述的数值范围内的任何值。电穿孔培养基可以是本 领域中已知的任何合适培养基。优选地，电穿孔培养基具有范围跨越0. 01至1. 0毫西门子 的导电性。
[0212] 在【具体实施方式】中，作为非限制性实例，所述RNA编码罕见切割核酸内切酶，罕见 切割核酸内切酶的一个单体，如半TALE核酸酶（Half-TALE-nuclease)、嵌合抗原受体、多 链嵌合抗原受体的至少一种组分、pT a或其功能性变体、外源核酸、一个另外的催化结构 域。
[0213] 修饰的T细朐
[0214] 本发明还涉及要通过工程化细胞的所述方法易于获得的分离的细胞或细胞系。特 别是，所述分离的细胞包括如上所描述的至少一种多链CAR。在另一个实施方式中，所述分 离的细胞包括每一个包括不同胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。特别是，所述分离 的细胞包括编码组成至少一种多链CAR的多肽的外源多核苷酸序列。所述细胞还可以进一 步包括至少一种失活基因，其选自由^52、61?、1'0?€ [、1'0?|3、111^基因、免疫检查点基因如 PD1和CTLA-4组成的组，或可以表达pTa转基因。
[0215] 在本发明的范围内也包括分离的免疫细胞，优选根据任何一个前述方法获得的T 细胞。所述免疫细胞是指造血起源的细胞，其功能上参与先天和/或适应性免疫应答的启 动和/或执行。根据本发明的所述免疫细胞可以源自干细胞。干细胞可以是成熟干细胞、胚 胎干细胞，更具体是非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、 全能性干细胞或造血干细胞。代表性的人类细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是 树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，其选自由炎性T淋巴细 胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞组成的组。在另一个实施方 式中，所述细胞可以源自由⑶4+T淋巴细胞和⑶8+T淋巴细胞组成的组。在扩增和遗传修 饰本发明细胞的之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞的来源。细胞可以获 自一些非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感 染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用可获 得的并且是本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在另一个实施方式中，所述细胞 可以源自健康供体、诊断患有癌症的患者或诊断为感染的患者。在另一个实施方式中，所述 细胞是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的部分。在本发明的范围内也包括根据前述方 法从转化的T细胞获得的细胞系。耐免疫抑制性治疗并且通过前述方法易于获得的修饰的 细胞包括在本发明的范围内。
[0216] 在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包括一种失活基因，选自由 CD52、GR、PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、 TCRa和TCR0组成的组，和/或表达CAR、多链CAR和/或pTa转基因。在另一个具体实 施方式中，所述分离的细胞包括编码组成多链CAR的所述多肽的多核苷酸。
[0217] 在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包括两种失活基因，其选自 由以下组成的组：CD52 和 GR、CD52 和 TCR a、CDR52 和 TCR 0、GR 和 TCR a、GR 和 TCR 0、 TCR a 和 TCR 0、PD1 和 TCR a、PD1 和 TCR 0、CTLA-4 和 TCR a、CTLA-4 和 TCR 0、LAG3 和 TCR a、LAG3 和 TCR 0、Tim3 和 TCR a、Tim3 和 TCR 0、BTLA 和 TCR a、BTLA 和 TCR 0、BY55 和 TCR a、BY55 和 TCR 0、TIGIT 和 TCR a、TIGIT 和 TCR 0、B7H5 和 TCR a、B7H5 和 TCR 0、 LAIR1 和 TCR a、LAIR1 和 TCR 0、SIGLEC10 和 TCR a、SIGLEC10 和 TCR 0、2B4 和 TCR a、2B4 和TCR 0，和/或表达CAR、多链CAR和/或pT a转基因。