pH控制的酵母繁殖的制作方法
【专利说明】pH控制的酵母繁殖 发明领域
[0001] 本发明涉及酵母的繁殖方法。特别地，本发明涉及这样的繁殖方法，其中酵母基于 木质纤维素水解物繁殖。
[0002] 发明背景
[0003]目前存在这样的方法，其提出使用木质纤维素材料作为燃料生产和基础化学品生 产的来源。它们旨在商业上可行地从木质纤维素原料生产这些产品。
[0004] 在所述方法中，木质纤维素材料可例如被预处理，然后被水解，随后由此得到的包 含己糖和/或戊糖的水解物可被酵母转化为发酵产物。这些方法可在大规模集成生物过程 设施（IBF)中发生。酵母发酵通常在IBF的发酵部分中在厌氧条件下进行。
[0005] 为了能够为发酵供应足够的酵母，使酵母在IBF中繁殖或者在别处繁殖并转移到 IBF中。通常在有氧条件下进行繁殖。
[0006] 从德国专利300662,已知有氧繁殖酵母的方法，其中繁殖开始于被强烈稀释的培 养液中，然后缓慢加入未稀释的培养液。缓慢加入培养液的过程部分在本文中被称为方法 的补料分批阶段。包括补料分批阶段的整个方法在本文中被称为补料分批方法。已知的补 料分批方法的优势为：避免了形成过多乙醇，并可使用比稀释分批方法中更高的培养液浓 度。
[0007]从 Kollaras, A.等人，Ethanol Producer Magazine, 2012 年 8 月，52-54 页，存在 已知的基于含木糖的II馏物的酵母（S. cerevisiae)的有氧繁殖，其被描述为："在类似于 生长面包酵母的繁殖器的浸没式（submerged)有氧繁殖器中，S.cerevisiae MBG 3248将 乙酸、乳酸、乙醇、甘油、残留的六碳糖和木糖转化为酵母生物质，且表观产率为〇.35g酵母 /g总可用碳"。这种已知方法的缺点为：由于富含木糖的釜馏物被用于形成生物质，所以产 生过量酵母（129, 000吨饲料酵母）。在饲料酵母中被转化的木糖可被更好地用于在IBF中 生产发酵产物。所有目前已知的基于酸性木质纤维素水解物的繁殖方法的缺点为：酵母生 长被乙酸和/或糖降解产物抑制。尽管如此，这种水解物可存在并可从IBF获得，且比常规 的繁殖碳源便宜，因此其将成为期望的碳源。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供这样的繁殖方法，其中木质纤维素水解物可被用作碳源。另 一个目的是提供这样的繁殖方法，其可以以稳定方式被操作。另一个目的是提供这样的繁 殖方法，其可以在多重循环中被执行，其中部分繁殖混合物被用于下一轮繁殖。另一个目的 是提供这样的繁殖方法，其避免过量生产酵母。根据本发明达到这些目的中的一个或多个。 [0009] 根据本发明，提供有氧繁殖酵母的方法，其中酵母在反应器中生长，所述方法包括 下述步骤：
[0010] a)用碳源和初始酵母菌群填充所述反应器，
[0011] b)任选地使所述反应器中的所述初始酵母菌群以分批模式生长，
[0012] c)测量所述反应器中的pH，
[0013] d)繁殖，同时以一定速率以补料分批模式向所述反应器中加入木质纤维素水解物 以将所述反应器中的pH设定为预定值，和
[0014] e)充分繁殖后，从所述反应器中分离酵母。
[0015] 根据本发明，获得了可使用木质纤维素水解物作为碳源的繁殖方法，其可以以稳 定方式、在多重循环中被操作并避免过量生产酵母。
[0016] 根据本发明的繁殖的另一个优势是：使酵母在基于水解物的一个或多个循环中的 繁殖期间以这样的方式适应，使得与未根据本发明基于水解物繁殖的酵母相比，其在木质 纤维素水解物的乙醇发酵方面的性能增强。
[0017] 本发明还提供：
[0018] -根据上述繁殖方法生产的酵母，和
[0019] -生产发酵产物的方法，其使用根据上述繁殖方法的酵母，特别地其中所述发酵产 物是乙醇。 附图简介
[0020] 图1 :酵母繁殖期间根据时间（h)的糖消耗和乙醇产量。实心正方形是糖浓度的 测量值（g/1)。空心圆形是乙醇浓度（g/L)。参见图例。
[0021] 图2 :根据时间（h)的生物质形成和抑制剂浓度。三角形表示抑制剂浓度（g/1); 用实线代表乙酸浓度。空心圆形加实线表示由0D700计算出的生物质（酵母）浓度（作为 干物质）（g/1)。甘油浓度被表示为空心圆形加中断线。参见图例。
[0022] 图3 :根据时间（h)的繁殖器参数。氧浓度（p02(% ))_? _，pH-，温度（°C )_。 参见图例。
[0023] 图4 :酵母生长。根据时间（h)展示（以质量（X)计）。曲线的直线部分表示指数 生长。参见图例。
[0024] 发明详沐
[0025] 贯穿本说明书和随同的权利要求，词语"包含"、"包括"及其变体应被包含地解释。 换言之，当语境允许时，这些词语旨在表达可能包含未明确列举的其它元素或整体。
[0026] 本文中的反应器、繁殖器或发酵器可被用于指其中可发生繁殖的反应器。本文中 的繁殖是有氧发酵，其目的是增加酵母菌群。本文中的乙醇发酵涉及目的是产生乙醇的发 酵且通常在厌氧条件下进行。本文中乙醇发酵发生于其中的反应器是乙醇发酵器或乙醇反 应器。
[0027] 根据本发明，有氧繁殖酵母（其中酵母生长于反应器中）包括下述步骤：
[0028] a)用碳源和初始酵母菌群填充所述反应器，
[0029] b)任选地使所述反应器中的所述初始酵母菌群以分批模式生长，
[0030] C)测量所述反应器中的pH，
[0031] d)繁殖，同时以一定速率以补料分批模式向所述反应器中加入木质纤维素水解物 以将pH保持为预定值，和
[0032] e)充分繁殖后，从所述反应器中分离酵母。
[0033] 在这种方法中，步骤a)、b)和e)可以常规方式进行，但这些步骤中的一些参数可 不同于特定的已知常规方法中的参数，如下文中更详细所述。在步骤a)中，可使用任何合 适的碳源。在一种实施方式中，在步骤a)中，碳源是稀释的木质纤维素水解物，更具体地， 在水中稀释至2倍或更多倍的木质纤维素水解物。
[0034]在步骤c)中，可利用任何常规的pH测量仪器测量繁殖反应器（本文中也被称为 繁殖器）中的PH，例如工业上使用的pH探针或工业上使用的pH控制器。pH值被用来引发 木质纤维素水解物的供给的启动，即繁殖的补料分批阶段的启动。在步骤c)中，来自pH探 针或控制器的信号可被用于打开与木质纤维素水解物的供给线相连的计量阀。
[0035] 在步骤d)补料分批阶段中，以将pH设定为在预定值下的反应器中的pH的方式， 使用pH探针信号或pH控制器信号来提供通过计量阀进入反应器的木质纤维素水解物的受 控制的供给速率。预定值可以是单一 pH值或者可随时间变化（如果pH曲线被设定）。在 一种实施方式中，pH预定值基本上恒定。在这种实施方式中，补料分批阶段繁殖器中的pH 为pH从4到10或pH从4到7。在一种实施方式中，以使繁殖器中的混合物的pH保持高于 被注入所述繁殖器中的木质纤维素水解物的pH的速率供给木质纤维素水解物。
[0036] 木质纤维素水解物可以是酸性的。在一种实施方式中，木质纤维素水解物包含有 机酸。可存在于木质纤维素水解物中的有机酸的实例是乙酸和甲酸。在一种实施方式中， 有机酸是乙酸。酸性木质纤维素水解物是来自其中使用酸的预处理的常见产物，其导致形 成乙酸。
[0037] 因此，在步骤d)中，在补料分批繁殖期间，以pH受控制的速率向繁殖器中的酵母 供给碳源和任选地其它成分（如磷酸、氨和矿物质）。该速率被设计成向酵母供给刚好足够 的糖和营养物以最大化增殖且同时刚好足够低以阻止乙醇的生产，并且来自进料的所有或 大部分乙酸和/或其它酸性抑制剂被消耗。
[0038] 在一种实施方式中，酵母消耗木质纤维素水解物中的木糖，优选地基本上所有木 糖。
[0039] 在一种实施方式中，方法中不需要向反应器中的混合物中加入碱。在一种实施方 式中，繁殖期间的乙酸浓度（g/L)为0.5g/L或更低，优选地0.2g/L或更低。
[0040] 在一种实施方式中，进行繁殖直至实现酵母菌群至少生长5代。在一种实施方式 中，进行繁殖直至相较于初始酵母菌群，酵母菌群生长5-6代。在一种实施方式中，进行繁 殖的分批阶段直至酵母菌群生长2代且进行繁殖的补料分批阶段直至酵母菌群生长3代或 更多代。本文中生长的代表示以重量（g)计的酵母生物质的加倍。
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