041] 分批培养中的指数牛长
[0042] 本文中"代"的定义是酵母生物质的加倍。生物质的量的加倍可通过给定时间的 Cx (生物质浓度）描述，Cx通过下述方程被给出：
[0043] Cx(t) = (方程 1)
[0044] 可以通过代入Cx(t) = 2*Cx(0)由所述方程得到加倍时间（Td，以小时计）或传代 时间（Tg，以小时计）。
[0045] Td = LN (2) / y (hr)(方程 2)
[0046] 其中，y =以g生物质/g生物质/h或1/h为单位的比生长速率。
[0047] 可通过多种手段测量生物质生长速率：可通过使用任何下述方法或合适的替代性 方法来测定每重量或体积单位的培养物的细胞量从而分析生物质量的增加：
[0048] ?浊度
[0049] ?培养物在可见光谱（通常范围：600nm-700nm)中的光密度
[0050] ?离心后的沉淀体积
[0051] ?在105°C下恒重干燥后的干重含量
[0052] ?每体积的细胞计数（通过显微镜）
[0053] ?涂布在固体琼脂培养基上并在平板上从单个细胞生长成菌落后的菌落形成单位 (CFU/ml)
[0054] 或者，可以由从闭合反应器体系中测量到的代谢活性来得到生物质的量，例如：
[0055] ?二氧化碳产生速率（CPR二氧化碳产生速率或者CER二氧化碳释放速率，通常被 表示为 mmol C02/L/hr)
[0056] ?氧消耗速率（OUR摄氧速率，mmol 02/L. hr)
[0057] ?底物摄取速率（rs =以g/L. hr计的底物摄取速率，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或氨 的摄取速率）
[0058] 当在指数生长实验（没有营养限制且没有形成有毒产物）中相对于时间标绘 Ln(Cx)或LN(CPR)、LN(0UR)或LN(rs)或时，获得了斜率为比生长速率y的直线。利用y 和方程2,能够计算出加倍时间；利用生长时间，能够计算出加倍的量或代数。
[0059] 非指数牛长
[0060] 在非指数生长实验（例如恒定进料的补料分批发酵或连续发酵）中，通过计算下 述来判断代的量
[0061] Mx = Cx*体积（以g/L计的生物质浓度*在gr生物质中产生的培养液的升数） (方程3.)
[0062] 得到总CFU的g干重中酵母生物质的总质量（=CFU/ml*产生的培养物的ml数， 或者0D*vol)。
[0063] Mx的两倍增加表示一代。
[0064] 非指数生长的原理也可适用于上述指数生长体系。
[0065]在步骤e)中，充分繁殖之后，酵母可从反应器中分离或者作为全培养液供给乙醇 发酵反应器。这些步骤可以以常规方式被执行。在一种实施方式中，繁殖的酵母的一部分 被再循环至繁殖器中。
[0066] 酵母菌群
[0067] 初始酵母菌群应该具有合适的大小，这取决于繁殖反应器的大小和反应器中可利 用的碳源的量。在一种实施方式中，初始酵母菌群可来源于合适酵母菌株的纯净培养管或 冷冻小瓶。纯净培养管或冷冻小瓶可被用作预-纯净培养罐（其中种子在严格无菌条件下 于培养基中生长的小压力容器）的接种物。生长之后，将该容器的内容物转移至较大的纯 净培养反应器中，在所述反应器中通气并再次在无菌条件下进行繁殖。将长成的细胞从纯 净培养容器转移至一系列逐步增多的种子和半-种子繁殖器中。这些早期阶段作为分批发 酵进行。
[0068] 在一种实施方式中，酵母能够代谢有机酸，优选地代谢乙酸。我们已经发现：酵母 (尤其是S.cerevisiae)能够消耗乙酸和其它有机酸，如果它们以低浓度（例如5g/l或更 低，4g/l或更低，3g/l或更低，2g/l或更低，lg/1或更低，或0. 5g/l或更低）存在且仅当糖 和其它碳源已被耗尽时。
[0069] 在繁殖方法中被用作初始酵母菌群的酵母可以是（基因工程）酵母。基因工 程将在下文中更详细描述。酵母在本文中被定义为：真核微生物，其包括主要以单细胞 形式生长的 Eumycotina 亚门的所有物种（Alexopoulos, C. J.，1962, In: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc. , New York)
[0070] 酵母可通过单细胞菌体的出芽生长或者可通过生物体的分裂生长。作为酵母的优 选酵母可属于 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、 Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia属。优选地，酵母能够厌氧发酵，更优 选地能够厌氧乙醇发酵。在一种实施方式中，酵母是Saccharomyces cerevisiae。
[0071] 在一种实施方式中，酵母是工业酵母。工业酵母细胞可被定义如下。工业方法中 酵母细胞的生存环境与实验室中的生存环境显著不同。工业酵母细胞必须能够在多种环 境条件下表现优异，所述环境条件可在方法期间变化。所述变化包括营养物来源、PH、乙醇 浓度、温度、氧浓度等的改变，它们共同潜在影响Saccharomyces cerevisiae的细胞生长和 乙醇生产。在不利的工业条件下，环境耐受菌株应该允许强健的生长和生产。工业酵母菌 株通常对这些可出现在使用它们的应用（例如烘烤工业、酿造工业、酿酒和乙醇工业）中 的环境条件变化更强健。工业酵母（S. cerevisiae)的实例是基因工程的Ethanol Red? (Fermentis) Fermio丨<X*SM)和Thermosacc? (Lallemand)。在一种实施方式中，酵母 有抑制剂耐受性。可通过筛选在含抑制剂的材料上生长的菌株来选择抑制剂耐受性酵母 细胞，例如 Kadar 等人，Appl. Biochem. Biotechnol. (2007)，136-140 卷，847-858 页中所阐 释，其中抑制剂耐受性S. cerevisiae菌株ATCC 26602被选择。RN1016是来自DSM, Bergen op Zoom,荷兰的发酵木糖和葡萄糖的S. cerevisiae菌株。
[0072] 在一种实施方式中，酵母能够转化己（C6)糖和戊（C5)糖。在一种实施方式中，酵 母能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除了厌氧发酵葡萄糖之外，酵母 能够利用L-阿拉伯糖和木糖。在一种实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核 酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化为期望的发酵产物，例如转化为乙醇。可通过引入 来自合适来源的araA(L_阿拉伯糖异构酶）、araB(L-ribuloglyoxalate)和araD(L_核酮 糖-5-P4-差向异构酶）基因来修饰宿主酵母从而产生能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物 体（例如S. cerevisiae菌株）。可向宿主细胞中引入所述基因以使它能够利用阿拉伯糖。 W02003/095627中描述给出了这种方式。可以使用来自Lactobacillus plantarum的araA、 araB和araD基因，其被公开于W02008/041840中。可以使用来自Bacillus subtilis的 araA基因和来自Escherichia coli的araB和araD基因，其被公开于EP1499708中。在另一 个实施方式中，如W02009011591中所公开，araA、araB和araD基因可来源于Clavibacter、 Arthrobacter 和 / 或 Gramella 属中的至少一种，特别地 Clavibacter michiganensis、 Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii中的至少一种。在一种实施方式中， 酵母还可包含木糖异构酶基因的一个或多个拷贝或木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶的一 个或多个拷贝。
[0073] 酵母可包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的实例是引入一 个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，缺失醛糖还原酶（GRE3) 基因，过表达PPP-基因TALI、TKL1、RPE1和RKI1以允许细胞中通过戊糖磷酸途径的流量 (flux)增加。基因工程酵母的实例被描述于EP1468093和/或W02006009434中。如图1 中所示，这种酵母展示出特定的碳源利用偏好；葡萄糖首先被摄取并被转化为酵母生物质 和副产物，最主要是乙醇