（由于反巴士德效应（Crabtree effect))。随着葡萄糖浓度降低， 戊糖（木糖）被消耗，此时，乙醇生产由于糖酵解流量的减少而停止（没有更多的溢流代 谢）。在稍后的木糖利用阶段，之前生产的乙醇以及乙酸被代谢，后者引起发酵液的pH上 升。通过供给未稀释的酸性水解物，pH被固定在沿着这条pH斜线的某一点，从而有效保持 补料阶段期间的乙酸浓度低于分批阶段和未稀释的水解物进料中的乙酸浓度。
[0074] 随着乙酸的消耗（这导致pH上升）在木糖和乙醇二者的消耗之后发生，或与木糖 和乙醇二者的消耗至少部分重叠地发生，使用这种补料策略的繁殖方法有意并不可避免地 产生戊糖浓度耗尽或至少强烈降低的培养液。这些戊糖还被转化为酵母生物质，这增加了 培养液中的总酵母生物质浓度，从而允许较小的装机（installed)通气发酵体积（capex)。 这与W02011/022840(Geertman)根本上不同，W02011/022840中通过转化己糖同时最小化 戊糖转化来追求木糖/葡萄糖比例的增加。为了进一步阐释这种根本差异，使用如上所述 的菌株联合后一种策略将导致极其有限的通过乙酸转化的解毒作用，甚至没有通过乙酸转 化的解毒作用，因为在所述菌株中戊糖转化与戊糖摄取强烈重叠。由于所述补料策略旨在 消除或至少使乙酸浓度最小化（并且从而使繁殖的酵母的抑制最小化），所以它比通过即 时乙醇测量来控制/限制未稀释水解物的供给（Petersson等人2006, Andreas等人2007) 有下述优势：在后者中，在酵母代谢培养液中的乙酸之前供给未稀释的水解物，因此培养液 中的乙酸未被连续消耗，从而缺乏解毒效果，并仍然严重遭受酵母的生长抑制，尤其是在工 业水解物中常见的乙酸浓度（多5g/l)下。在集成生物过程设施中，本文中繁殖的酵母的 发酵产物可以是任何有用的产物。在一个实施方式中，它是选自由乙醇，正丁醇，异丁醇， 乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二 酸，氨基酸（例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸），1，3-丙烷-二醇，乙烯， 甘油，0 _内酰胺抗生素和头孢菌素，微生物，药物，动物饲料补充剂，特殊化学品，化学原 料，塑料，溶剂，燃料（包括生物燃料和生物气或有机聚合物）和工业酶（例如蛋白酶、纤 维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶）组成的 组的产物。例如，可通过遵循现有技术中的细胞制备方法和发酵方法并利用根据本发明繁 殖的酵母来生产发酵产物，但其实例在本文中不应被理解为限制。可如W02008121701或 W02008086124中所述通过细胞生产正丁醇；如US2011053231或US2010137551中所述生产 乳酸；如W02009153047中所述生产丙烯酸。
[0075]使用现有技术来回收集成生物过程设备中的发酵产物。不同回收方法适用于不同 发酵产物。从水性混合物中回收乙醇的现有方法通常使用分馏和吸附技术。例如，啤酒仍然 能够被用来处理发酵产物（其在水性混合物中含有乙醇）以产生浓缩的含乙醇的混合物， 该混合物然后经受分馏（例如，分级蒸馏或其它类似技术）。接下来，含最高浓度乙醇的级 分可通过吸附器以从乙醇中除去大部分的（如果不是所有的）剩余水。
[0076] 繁殖
[0077] 本文中的繁殖是导致起始酵母菌群增加的任何酵母生长的方法。繁殖的主要目的 是利用酵母作为活的生物体的自然增殖能力来增加酵母菌群。可存在其它的繁殖原因，例 如，如果使用干酵母，那么在使酵母生长之前，利用繁殖来使酵母再水化和适应。新鲜酵母 (活性干酵母或湿糕（wet cake))可被加入以直接启动繁殖。
[0078] 繁殖条件对最佳的酵母生产和随后的发酵（例如将木质纤维素水解物发酵为乙 醇）很关键。它们包括适当的碳源、通气、温度和营养添加。繁殖罐的尺寸通常在（木质纤 维素水解物向乙醇）发酵器尺寸的2%和5%之间。
[0079] 首先，酵母需要碳源。本文中，补料分批阶段的碳源为木质纤维素水解物。细胞壁 生物合成以及蛋白质和能量的生产需要碳源。
[0080] 对于分批阶段，碳源可以是稀释的木质纤维素水解物。稀释（用水）是有益的，因 为如果酵母基于未稀释的木质纤维素水解物繁殖，由于其通常含有过高水平的抑制剂，所 有它对酵母有毒。这表示：当繁殖极其缓慢进行时，可能的代数为约至多2且繁殖的酵母将 具有不好的发酵特性。本领域技术人员可基于木质纤维素水解物的糖含量和抑制剂水平来 判断稀释因子。在一种实施方式中，碳源是在水中稀释至2倍或更多倍，多于3倍，多于4 倍，多于5倍或6、7、8、9、10、15或20倍的木质纤维素水解物。在分批阶段，还可以使用不 同于稀释的木质纤维素水解物的其它碳源。碳源可以是任何形式的糖，例如葡萄糖，且糖可 以为任何形式，例如结晶的或不太纯净的形式例如极浓的糖浆（melasse)。
[0081] 在一种实施方式中，在分批阶段，糖水平在发酵开始被定在2% (重量/重量）或 仅比2% (重量/重量）高一点。由于这种浓度高于引起反巴斯德效应的浓度，因此乙醇 被生产，参见实施例1，图1，其中乙醇浓度首先增加。然而，我们发现：在糖和甘油被耗尽之 后，这种乙醇随后被酵母消耗。此外，我们发现：然后，乙醇和乙酸和其它酸被消耗（参见实 施例1，图2)。乙酸和/或其它酸被消耗后，繁殖器中的pH将升高。这种pH升高被用于本 发明中。
[0082] 除了碳源之外，可加入木质纤维素水解物中天然提供的上述额外营养物以优化生 长。氮（例如，尿素的形式）最经常以每百万300份至每百万500份之间或更高的比例被 使用。虽然氨也是良好的酵母氮源，但它能够在再水化期间抑制酵母。未加入额外的氮可 引起缓滞的酵母生长，从而导致反常低的酵母计数或较慢的代谢。额外成分（如镁和锌） 有时被加入用于额外益处。
[0083] 繁殖是有氧过程，因此繁殖罐必须适当通气以维持一定水平的溶氧。通常通过在 进入繁殖罐的管道上安装空气引导器来实现适当的通气，所述引导器在繁殖罐填充时和循 环期间将空气引入繁殖混合物中。繁殖混合物保持溶氧的能力是加入空气的量和混合物的 稠度的函数，这就是为什么经常以50:50至90:10之间的糊状物与水的比率加入水。"粘稠 的"繁殖混合物（80:20的糊状物与水的比率以及更高）经常需要加入压缩空气以弥补降低 的保持溶氧的能力。繁殖混合物中溶氧的量还是气泡大小的函数，因此一些乙醇工厂通过 喷洒器加入空气，所述喷洒器与空气引导器相比产生较小气泡。伴随较低的葡萄糖，适当通 气对促进有氧呼吸很重要，这与发酵的相对地厌氧环境不同。通气不足或高葡萄糖浓度的 一个标志是繁殖罐中增加的乙醇产量。
[0084] 通常在繁殖期间，酵母需要舒适的温度来生产和代谢，例如繁殖反应器中的温度 在25-40°C之间。较低温度通常导致较慢的代谢和减少的增殖，而较高温度能够引起压力化 合物（stress compounds)的产生和增殖减少。在一种实施方式中，繁殖罐在室内并被保护 不受盛夏或寒冬温度的伤害，因此维持在30-35°C范围内之间的最适温度通常不是难题。 [0085]另一个常见问题是：在将酵母加入繁殖器之前使其繁殖多久。工厂之间的繁殖时 间不同，但最经常在6-100小时之间变化。指示可以是酵母达到指数生长期所花费的时间。 较长的繁殖周期可导致酵母进入稳定期或衰退阶段，因为营养物被耗尽以及副产物（例如 乙酸）积累，随后一旦进入繁殖器中这可引起酵母性能滞后。
[0086] 较短的繁殖周期不允许使酵母适当加倍或增殖的时间，这是首先繁殖的主要原因 之一。测定繁殖的最佳下降数（drop times)可能涉及绘制上述条件下的生长图表并判定 酵母何时已达到指数生长（涉及酵母何时进入随后的稳定阶段或快速衰退阶段）。
[0087]细菌或野生酵母污染是繁殖期间的罕见问题，因为酵母繁殖罐比发酵罐小且能更 容易清洁。除了清洁之外，可加入抗细菌产品以阻止不想要的微生物的生长。
[0088] 总而言之，酵母繁殖是燃料乙醇生产过程的不可分割部分。通过遵循上述指导方 针，可优化繁殖并最小化发酵中的难题。
[0089] 在补料分批繁殖期间，以控制速率向繁殖器中的酵母供给碳源和任选地其它成分 (如磷酸、氨和矿物质）。该速率被设计成向酵母供给刚好足够的糖和营养物以最大化增殖 并阻止乙醇的产生。在一种实施方式中，木质纤维素水解物注入补料分批反应器的速率为 〇. lotr1 或更低，或者从 〇. oitr1 至 〇. lotr1。
[0090] 在一种实施方式中，补料分批发酵不是完全无菌的。使用加压罐来确保这些发酵 器（繁殖器）中所需