MP2-、EBNA1和BARF1--的CTL的生产策略。
[0062] 在发明人--本领域的引领者--的工作前，并不知道肽是否可用于生成预防和 治疗病毒感染和病毒相关癌症的自体抗原特异性T细胞群。也不知道可使用于本方法的树 突细胞或T-APC能够有效用作应用所述肽的抗原递呈细胞。而且，T细胞对肽的应答似乎 与免疫系统识别的天然加工肽的环境相关。
[0063] 本发明显示出在（自体）抗原特异性T细胞制剂的制备中非常重要的进步，并且 这很可能导致对患者和医师的实践效益。
[0064] 在本公开的扩大T细胞群中重要的因素是：
[0065] ?T细胞对各被识别表位的亲合力，
[0066] ?各抗原中被识别表位的数量，
[0067] ?被识别抗原的数量，
[0068] ?T细胞的扩大倍数和具有预期特异性的T细胞的频率。
[0069] 附图简述
[0070] 图1显示生成EVB特异性T细胞的现有技术方法的图示。该方法需要生产用于第 一轮激活/扩大的自体树突细胞（DC)和用于随后几轮激活/扩大的类淋巴母细胞细胞系 (LCL)。Dcs和LCL均转染有腺病毒载体，该腺病毒载体包含选择的EBV抗原，以刺激EBV特 异性T细胞生长。
[0071] 图2显示本发明不同实施方式的图示。图中通过显示利用肽生成EBNA1、LMP1和 LMP2特异性T细胞显示本发明的方法。在所有新方法中，腺病毒载体的应用作为提供抗原 (一种或多种）的方式被替换为外源肽（一种或多种）的添加。而且，LCL对于第二轮激活 /扩大的应用被取消，而替换为肽负载的自体DC或肽负载的抗原递呈自体T细胞（T-APC) 和aK562细胞。另一实施方式显示，第一刺激可在不使用DC的情况下进行，并且利用PBMC 群中存在的抗原递呈细胞。
[0072]PBMC、DC和T-APC的生成分别在本文的方案1、2和3中得到描述。
[0073] 图3该系列中的图显示利用本发明权利要求1的步骤b)中的T-APC、通过aK562 对T细胞扩大的刺激。这证实了新系统的应用实现第二轮激活/扩大的有效抗原特异性T 细胞刺激。其基于惊人的发现：可通过两种独立的组分提供第一（抗原特异性的，刺激）信 号和第二（共同刺激）信号。在所示实例中，第一信号由肽负载T-APC提供，并且第二信号 由经修饰递呈共同刺激分子的aK562细胞提供，而非MHC。其如本发明权利要求1的步骤 b)的说明。
[0074] 图3A显示根据本发明权利要求1的步骤b)利用aK562和T-APC的T细胞扩大。 该图显示在方法第二刺激期间采用不同CTL:T-APC:aK562比的6个正常供体的结果和所得 的细胞扩大。显示1:1:5的比在大部分供体中是最佳的。
[0075] 图3B显示本发明权利要求1的步骤b)中T细胞扩大的最佳CTL与aK562与 T-APC的比。结果通过如下产生：比较（C)扩大倍数（如图3A单独证实），（D)培养物中 CD56+、CD3-细胞的百分比，和（E)采用不同细胞与细胞的比生成的最终细胞产物的干扰 素1 (IFNg)ELISPOT中的应答（SCF=斑点形成菌落）。
[0076] 图3C显示在采用CTL与T-APC与aK562细胞的不同比和不同抗原的EBV特异性 T细胞的培养中的干扰素Y分泌细胞的比较。显示在ELISP0T分析中生成IFNg的最终培 养物中的细胞数量--在2个单独供体中，在第二刺激后，处于不同培养比。这显示的是3 种单独的目标EBV抗原和无抗原对照。
[0077] 图3D显示T-APC可充当HLAI和II类限制抗原的抗原递呈细胞。
[0078]A.在用0KT3和⑶28抗体（T-APC)激活PBMC后，T细胞将开始上调HLAII类以 及共同刺激分子如⑶80、⑶83、⑶86和4-1BBL。虽然HLAII类在一周结束时达到100%， 但共同刺激分子的水平是暂时的，并且保持低迷。
[0079]B.aK562是HLA(_)ve白血病细胞系，其已经改造以表达稳定高水平的⑶80、⑶83、 CD86 和 4-1BBL。
[0080] 图4该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大来自健康供体 的EBV特异性细胞的结果。
[0081] 图4A是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。该图显 示现有技术--阴影框中--和用于指代第一和第二刺激的命名。首先显示用作APC的细 胞类型，然后是递送抗原的方式（Ad载体或肽-Px)。关于利用T-APC和aK562+肽的实施 方式，在数据中缩写为ATC。
[0082] 图4B显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞的扩大。该图 显示9个健康供体的结果概括。在利用现有技术和图4A所示的3种其他方法扩大EBV特 异性T细胞后，在第9、16和23天计数细胞，并且结果在下方以百万细胞显示。利用aK562 结合DC或T-APC的两种方法均显示明显优于现有技术的扩大。
[0083] 图4C显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞培养物中干 扰素Y分泌细胞的比较。在利用现有技术方法和本发明不同实施方式培养后，在EELISP0T 分析中用肽再刺激细胞群。来自三种目标抗原（EBNA-ULMP1和LMP2)的肽被用于分析，并 且与现有技术相比，应答相同或增强。显示了一个代表性实例（共9健康供体），然后是核 对利用ATC的实施方式的所有正常供体的信息的图。
[0084] 图4D显示通过现有技术和本发明不同实施方式扩大的EBV特异性T细胞的T细 胞受体亲和力。利用图4A所示不同方法将细胞培养至第16天，然后其在ELISP0T分析中 经渐增稀释度的肽再刺激，以确定本发明的新实施方式是否不利于T细胞受体与肽的亲合 力。事实上，对于各个EBV肽而言，新方法显示类似的亲合力，并且在EBNA1的案例中显示 显著增加的亲合力。
[0085] 图4E显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大的细胞的不同T细胞标记的 分布。在第16天，收集利用4种不同方法生成的T细胞，并利用流式细胞术使之免疫显型。 这显示，在现有技术方法和本发明实施方式之间细胞产物的组成不变。现有技术和新实施 方式之间在CD62L表达方面存在差异。其在天然和中枢记忆T细胞中表达，并且通过效应 记忆T细胞被下调。因此，这再次可视作本发明实施方式的优势。
[0086] 图4F显示利用现有技术的细胞培养致使应答偏向LCL细胞中表达的抗原，而非淋 巴瘤和NPC患者的EBV+癌细胞中存在的潜伏2型抗原。利用现有技术和本发明实施方式 生成细胞。这些细胞然后在ELISP0T分析中用多种EBV肽再刺激。这显示，现有技术方法 致使应答偏向特异性LCL显性表位，而新方法显示抗癌症相关抗原如EBNA1的活性增加。
[0087] 图5该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大NPC患者的EBV 特异性细胞的结果。
[0088] 图5A是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。该图显 示现有技术--阴影框中--和用于指代第一和第二刺激的命名。首先显示用作APC的细 胞类型，然后是递送抗原的方式（Ad载体或肽-Px)。关于利用T-APC和aK562+肽的实施 方式，在数据中缩写成ATC。
[0089] 图5B显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞的扩大。在 利用现有技术和图5A所示3种其他方法扩大EBV特异性T细胞后，在第9、16和23天计数 细胞，并且结果在下方以百万细胞或扩大倍数显示。这分别代表3和4个NPC供体。利用 aK562组合DC或T-APC的两种方法均显示显著优于现有技术的扩大。
[0090] 图5C显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞培养物中 的干扰素Y分泌细胞的比较。在利用现有技术方法和不同实施方式培养后，细胞群在 ELISP0T分析中用肽再刺激。应用来自三种目标抗原的肽，-EBNA-1、LMP1和LMP2,并且与 现有技术相比，NPC患者的应答增强。显示一个代表性实例。
[0091] 图显示通过现有技术和本发明不同实施方式扩大的EBV特异性T细胞的T细 胞受体亲和力。利用图5A所示不同方法将细胞培养至第16天。然后其在ELISP0T分析中 经渐增稀释度的肽再刺激，以确定本发明的新实施方式是否不利于T细胞受体与肽的亲合 力。事实上，对于各个EBV肽而言，新方法显示类似的亲合力，并且在EBNA1的案例中显示 显著增加的亲合力。
[0092] 图5E显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大的细胞的不同T细胞标记的 分布。在第31天，收集利用图5A所示4种不同方法生成的T细胞，并利用流式细胞术使之 免疫显型。这显示，现有技术方法和本发明实施方式之间细胞产物的组成不变。现有技术 和新实施方式之间在CD62L的表达方面存在差异。其在天然和中枢记忆T细胞中表达，并 且通过效应记忆T细胞被下调。因此，这再次可视作本发明实施方式的优势。
[0093] 关于图5A所示方法有一定变化。这是因为NPC患者细胞经历多于一次的再刺激 步骤。但是每次刺激的命名保持相同。该数据代表4个NPC患者。
[0094] 图5F显示比起通过现有技术扩大的T细胞，利用本发明的新实施方式扩大的NPC 患者的T细胞（⑶3+/⑶19-)在共同培养4和10天中更优地杀死LCL(EBV+癌细胞系，⑶3-/ CD19+)。T细胞和LCL以1:1的比温育。
[0095] 图6该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大淋巴瘤患者的 EBV特异性细胞的结果。
[0096] 图6A是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。该图显 示现有技术--阴影框中--和用于指代第一和第二刺激的命名。首先显示用作APC的细 胞类型，然后是递送抗原的方式（Ad载体或肽-Px)。关于利用T-APC和aK562+肽的实施 方式，如前述在数据中缩写成ATC，但在本部分数据中也可选地缩写成KATpx和ATpk。
[0097] 图6B显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞的扩大。在 利用现有技术和图6A所示3种其他方法扩大EBV特异性T细胞后，在第9和16天计数细 胞，并且结果在下方以百万细胞或扩大倍数显示。这代表4个淋巴瘤患者的细胞的结果。
[0098] 图6C显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞培养物中 的干扰素Y分泌细胞的比较。在利用现有技术方法和不同实施方式培养后，细胞群在 ELISP0T分析中用肽再刺激。应用来自三种目标抗原的肽，-EBNA-1、LMP1和LMP2,并且与 现有技术相比，淋巴瘤患者的应答增强。显示一个代表性实例。
[0099] 这些结果显示，当肽脉冲的PBMC或DC用于第一扩大时，抗原特异性T细胞的数量 在9天后相对于应用现有技术的培养显著增加。
[0100] 图6D显示利用本发明新实施方式扩大的淋巴瘤患者的T细胞（⑶3+/⑶19-)在共 同培养2或4天中与通过现有技术扩大的T细胞同等优异地或更优地杀死LCL(EBV+癌细 胞系，CD3-/CD19+)。T细胞和LCL以1:1的比温育。
[0101] 图7该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大健康供体的VZV 特异性细胞的结果。将PBMC在IL-4和IL-7存在的情况下用横跨VZV蛋白、gE、0RF10、 IE61、IE62和IE63的重叠肽库（15mers重叠11个氨基酸）（混合肽（pepmixes))脉冲。在 第9、16和23天，在表达共同刺激分子CD80、CD83、CD86和4-1BB配体（K562-cs)的aK562 细胞存在的情况下，将其用自体激活T细胞（AATC，T-APC)再刺激。该自体激活T细胞用相 同的混合肽脉冲，CTL与T-APC与K562-cs的比为1:1:5。其增至速率通过计数测量，并且 抗原特异性在Y干扰素ELISP0T分析中测量。
[0102] 图7A是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。
[0103] 图7B显示利用现有技术和本发明不同实施方式的EBV特异性T细胞的扩大。应 用上述方案扩大的T细胞的生长速率。>500倍扩大可经22天实现。
[0104] 图7C显示利用现有技术和本发明不同实