05,1至90 X 106,1至90 X 107， 1至90X 108或更多细胞，如80X 107细胞。
[0203] 在一个实施方式中，提供这样的方法：其中如果细胞在步骤b)后未充分扩大，其 可受到另外的刺激，该刺激利用如下：
[0204] (1)肽脉冲的、辐射后的自体激活T细胞和辐射后的共同刺激aK562细胞，
[0205] (2)辐射后的PBMC，来自血库认可的异源供体，和/或
[0206] (3)次促有丝分裂（submitogenic)剂量的抗⑶3 ;1 至 100ng/mL，例如，50ng/mL。
[0207] T-APC不是专业抗原递呈细胞。因此，除T-APC提供的抗原递呈外，还需要共同刺 激因子以刺激T细胞扩大和分化。
[0208] 本文所用的人造共同刺激因子是外源因子，其被加入培养物以提供T细胞激活信 号，从而补充T-APC抗原递呈信号，例如其中共同刺激因子和T-APC抗原递呈信号一起刺激 或促进自体T细胞以特定方式扩大，即，刺激靶细胞群，使得在其扩大时对靶抗原具有特异 性，其中特异性方面由T-APC引起。外源因子是不添加就不存在于PBMC培养物中或其中细 胞培养物中存在的天然存在量低并且通过添加外源因子量而增加的因子。
[0209] 承载⑶80/86的小珠可用作辅因子。带有抗⑶28 (⑶80/86的配体）和抗4-1BB 的小珠是可用的，但其还包含抗CD3,抗CD3消除所需的抗原介导的扩大特异性。因此在不 存在抗⑶3的情况下带有抗⑶28 (⑶80/86的配体）和抗4-1BB的小珠构成本公开的一方 面。
[0210] 在一个实施方式中，人造共同刺激因子是经改造在其表面上或关联其表面（参见 US 2003/0147869,关于细胞表面上某些抗体的关联）表达具体蛋白质（一种或多种）的细 胞或细胞系，例如aHLA阴性细胞系，并且该细胞或细胞系已经过遗传修饰以表达共同刺激 分子，如US 7, 745, 140公开的aK562细胞系。如后者的细胞系可用于本发明的方法以提供 延长的共同刺激信号。
[0211] 因此在一个实施方式中，细胞系，如aK562,不表达HLA。
[0212] 因此在一个实施方式中，细胞系，如aK562,不表达抗原。
[0213] 本文所用的aK562细胞可指代US 7, 745, 140描述的原始细胞系。但是，基于本 方法的目的，总体上，抗⑶3抗体不通常被负载于其表面上的Fcy受体上。优选地，本文 所述的aK562细胞是原始aK562细胞系的衍生体，其表面上包括至少一种，如一种、两种、 三种或四种共同刺激因子，其具体地独立地选自抗⑶28抗体、抗⑶80抗体、抗⑶86抗体和 4-1BBL。
[0214] 一种或多种辅因子可具有减少T细胞凋亡和诱导增殖循环--例如，约7至10次 细胞分裂--的作用。
[0215] 细胞经改造在其表面上表达共同刺激因子，其提供在T细胞刺激（激活或分化） 或存活中的重要信号，并且补充抗原在抗原递呈细胞表面的递呈所生成的信号。可在细胞 系表面上表达的分子实例选自⑶80、⑶86、⑶83,4-1BB配体及其组合，例如，其1、2、3、或4 种。这四种元件一起提供强共同刺激信号。
[0216] 在一个实施方式中，aK562细胞在其表面上进一步表达0X-40配体。
[0217] 这些细胞与上述T-APC -起作用，提供T细胞激活所需的全部信号。
[0218] ⑶80和⑶86结合⑶28--表面糖蛋白，存在于人体约80%的外周T细胞上。结 合T细胞受体的激活，该结合提供有效的T细胞刺激。另外，CD28 (在T细胞上）结合其配 体与T细胞受体的接合联合，诱导IL-2的产生。
[0219] 在一个实施方式中，步骤b)的培养仅包括内生IL-2。
[0220] 可选地，人造共同刺激因子可以是相关受体--如靶向例如⑶28的抗体--的激 动抗体。这些抗体可被直接提供在培养基中，或粘附于小珠，或可粘附于细胞系（如aK562) 表面。这被详细描述在US2003/0147869中，其被引入本文作为参考。
[0221] 在小珠上提供辅因子不能导致最有效的抗原特异性扩大。因此在一个实施方式 中，辅因子在细胞如aK562细胞上或关联细胞如aK562细胞被表达。
[0222] 用于本发明步骤b)的这种人造共同刺激细胞（如aK562)细胞似乎通过崭新的 并且令人惊讶的机制发挥作用。本公开的方法是可在一个细胞上提供抗原递呈并且可通 过不同细胞提供共同刺激以刺激和激活T细胞的首次证据。在生成抗原特异性T细胞的 背景下，这是非常令人惊讶的，因为在过去的实践中通常aK562细胞被改造以表达HLA分 子或靶向T细胞受体的抗体和建模体内系统--其中T细胞受体介导的信号和共同刺 激信号由一个细胞提供（即，两个细胞之间接触，并且例如，T细胞上的CD28连接与TCR 接合联合诱导IL-2的产生，该IL-2触发持续的增殖June等1994,Jenkins等1993和 Schwartz1992)。因此，已建立某些aK562细胞系，其表达MHC分类1A2和A3,fcitten， C.M. ；Meyer,R.G. ；Kreer,T. ；Drexler,I. ；Wolfcl,T. ；Herr,ff. (2002),^Theuseof HLA-A*0201-transfectedaK562asstandardantigen-presentingcellsforCD8(+) T lymphocytes in IFN-gamma ELISPOT assays"，Journal of Immunological Methods259(1 - 2):95 - 110，和（：1&4，1?.￡.山〇犯，1.八.；财11，3.(：.;1^11， <1.1?.;八1*6忖，6.; Macintyre, A. R. ；Rojas, J. ；Bourdon, A.等（2001)，"Direct evidence that leukemic cells present HLA-associated immunogenic peptides derived from the BCR-ABL b3a2 fusion pi'otein'Blood 98(10):2887 - 93。因此，在某些实施方式中，共同刺激细胞如 aK562细胞实际上是自主共同刺激因子（第三方共同刺激因子），其与T-APC -起刺激靶T 细胞群的抗原特异性扩大。虽然在理论上表达Fc受体和可负载有抗CD3抗体（如0KT3抗 体）以提供抗原不相关激活信号的aK562细胞可用于本方法，但在至少一个实施方式中， aK562 (或改造的细胞）不负载有抗⑶3抗体，因为通常非特异性信号是不期望的。
[0223] 本公开还扩展至改造细胞系如aK562细胞对于提供与T细胞如自体T细胞的扩大 中的抗原递呈不相关的人造共同刺激信号的应用。
[0224] 因此，在一个实施方式中，方法进一步的特征在于，步骤b)中扩大细胞群的方法 在如下背景下是令人惊讶的：仅依赖（1) T-APC ; (2)肽，脉冲/负载后者，和（3) aK562细胞， 被转导以仅表达共同刺激分子，而无抗原特异性递呈特性。所述这种方法实现了在抗原特 异性基础上的扩大（通过扩大过程中抗原特异性T细胞的增加百分比测量），尽管事实上 aK562细胞未被改造以递呈特异性抗原。在不在此步骤（例如DC)中添加其他APC的情况 下，扩大方法因此依赖T-APC来实现关于靶抗原递呈的第一信号激活。这是不常见的，因为 关于抗原递呈和共同刺激，T-APC均被认为是次佳的。aK562细胞提供共同刺激和增强扩大 的作用此前已被描述，但此前的论证显示一般CD3+T细胞扩大的代价是抗原特异性降低， 因为aK562细胞未被改造以递呈特异性抗原。在本发明中，抗原特异性随扩大增加，这表明 第一信号抗原识别步骤通过T-APC来实现，该T-APC与来自aK562细胞的第二信号共同刺 激协同作用。这种抗原递呈和共同刺激信号的二分背离当前接受的抗原特异性T细胞扩大 的模式--其中第一信号和第二信号由相同的APC递送。
[0225] 在一个实施方式中，本发明提供利用在第一细胞（或细胞群）上的抗原递呈和人 造共同刺激因子即第二不同细胞来刺激和激活抗原特异性T细胞扩大的方法。
[0226] 在一个实施方式中，改造细胞系，如aK562细胞系，被辐射后用于本公开方法前， 例如，用Y辐射源或X射线源。
[0227] 改造细胞系，如aK562细胞系，可以冷冻形式提供，在这种情况下，细胞的辐射可 在冷冻后进行。
[0228] 在一个实施方式中，CTL与共同刺激因子（例如，其中辅因子是细胞系）的比在分 别2:1至1:10的比内，如1:5。
[0229] 适当的CTL:抗体：共同刺激细胞比在1:1:0. 2至1:1:10范围内，如1:1:5。
[0230] 有利地，利用T-APC和人造共同刺激因子如改造细胞的方法，与现有技术方法相 t匕，可提供提高水平的抗原特异性T细胞扩大。
[0231] 用于步骤a)和任选地步骤b)的细胞因子（一种或多种）必须适于刺激和/或激 活T细胞生长或分化或发挥一些其他有用的功能，如促进T细胞存活或类似功能。
[0232] 可用于本公开方法的细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL_12和IL-15。
[0233] 在一个实施方式中，用于根据本公开的方法的细胞因子独立地选自IL-4、IL-7和 IL-15,如其组合。
[0234] 在一个实施方式中，在步骤a)中，所用细胞因子是IL-4和/或IL-7。虽然 不希望被理论束缚，但发明人认为这些细胞因子对于病毒抗原特异性细胞的频率、全谱 (repertoire)和扩大具有影响。
[0235]在一个实施方式中，如果IL-2用于步骤a)，则其在培养约第3或4天被添加，而非 在开始。
[0236] T细胞全谱可通过ELISP0T分析确定--在用肽库刺激后，该肽库被等份成池，使 得每种肤被独特显不在在两个池中（Kern, F.，N. Faulhaber, C. Frommel, E. Khatamzas, S. Prosch, C. Schonemann, I. Kretzschmar, R. Volkmer-Engert, H. D. Volk 和 P. Reinke. 2000. Analysis of CD8T cell reactivity to cytomegalovirus using protein-spanning pools of overlapping pentadecapeptides.Eur J Immunol. 30:1676-1682, 以及 Straathof, K. C. , A. M. Leen, E. L. Buza, G. Taylor, M. H. Huls, H. E. Heslop, C. M. Rooney 和 C. M. Bollard. 2005. Characterization of latent membrane protein 2specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175:4137-4147)〇
[0237] 在一个实施方式中，在步骤b)中，所用细胞因子是IL-15。虽然不希望被理论束 缚，发明人认为IL-15对相关T细胞群具有促存活作用。
[0238] 在一个实施方式中，用于步骤b)的细胞因子是IL-15。
[0239] 细胞因子如IL-15可在培养过程中更换，例如每周两次。
[0240] 在一个实施方式中，仅使用本文任一个实施方式中描述的具体细胞因子。
[0241] IL-12具有Thl集中的作用，并且如需平衡的Thl/Th2,可省略外源IL-12。在一个 实施方式中，本公开的方法不使用外源IL-12。但是，在当前T细胞产物的背景下，CD4+群 的Thl应答被认为是理想的。
[0242] 如适当，可在方法的任何阶段添加外源细胞因子，包括在细胞被转移到培养系统 时