施方式的EBV特异性T细胞培养物中的 干扰素Y分泌细胞的比较。来自6至9个健康VZV-血清阳性供体的T细胞的频率，该供 体在第0天用混合肽脉冲的PBMC或DC和在第9,16和23天用混合肽脉冲的自体激活T细 胞（T-APCS)+K-562-cs细胞激活后响应于VZV肽的刺激而分泌Y干扰素。每个符号表示 一个供体。本发明的实施方式一在第一扩大期间利用肽脉冲的PBMC或DC和在随后扩大 中利用T-APC组合aK562--对于所有使用的不同VZV抗原而言均导致靶CTL显著扩大。
[0105] 发明详述
[0106]自体T细胞是来自患者的细胞，即，患者本生（natural)的细胞，与来自供体的细 胞相反。某些与病毒感染相关的肿瘤已在患者体内建立生长的途径，不论病毒特异性T细 胞是否存在。这涉及抑制T细胞的分子的表达和病毒基因表达的调控。因此，这些患者的 T细胞可能降低对癌细胞的作用，其可以无反应性形式描述。
[0107] 在自体T细胞治疗中，从患者移除T细胞样品，用于尚体激活和扩大。在制备抗原 特异性T细胞群后，将其注入患者体内，在此T细胞细胞会进一步扩大，并将通过直接（细 胞毒性）和间接（免疫调节）机制消除递呈其靶抗原的细胞。
[0108] "T细胞"是本领域常用的术语，意图包括胸腺细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋 巴细胞、休眠T淋巴细胞或激活T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助（Th)细胞，例如，T辅助 l(Thl)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、⑶4+⑶8+T细胞、 ⑶4-⑶8-T细胞或任何其他T细胞亚组。
[0109] 本文所用的抗原特异性T细胞意图指代这样的的T细胞：识别具体抗原并对其响 应，例如，通过对其响应而增殖和/或生成细胞因子。
[0110] 在一个或多个实施方式中，方法不使用促进特异性的重组靶抗原。本文的重组抗 原指代通过重组技术制备的抗原的整体或大片段。相反，所用肽是抗原小片段，并且通常是 合成的。
[0111] 本发明涉及细胞离体处理和由其获得的T细胞产物。通常本发明不包括从患者获 得样品的步骤。
[0112] 从患者获得样品的步骤是采集血液样品的常规技术（其可经处理和任选地作为 物单采血液成分术（apheresis)产物提供）。此方法对患者呈现极小风险，并且无需由医师 实施，而可由适当培训的支持人员实施。在一个实施方式中，来自患者的样品为约200ml血 液或更少，例如，150ml或更少，如100-150ml的范围内。通常，需要至少约60ml血液。
[0113] 一般，用于T细胞扩大、DC生成和T-APC生成的PBMC得自血液或单采血液成分术 产物--通过本领域技术人员已知的Ficoll密度梯度分离。
[0114] Ficoll密度梯度分离采用合成的蔗糖聚合物--其浓度在方案过程中不同，以 在沉淀期间发挥不同细胞的分离。适当的反应剂可来自，例如，GE Healthcare,如Ficoll Paque?PLUS〇
[0115] 在一个实施方式中，负责采集血液样品或运送血液样品的中心在运输前通过 Ficoll密度梯度分离处理样品。
[0116] 在一个实施方式中，血液样品或处理后的血液样品在环境温度下运输，例如，在 4°C以上并且约30°C以下。
[0117] 在一个实施方式中，血液样品或处理后的血液样品被充入容器，如袋，其包括两 室，其中一室包含添加剂，如防腐剂和/或抗凝剂，并且血液或处理后的血液被充入第二 室，然后打破第一和第二室之间的密封，并将两室的内含物混合。
[0118] 本文所用的培养细胞意图指代体外激活和扩大和/或分化细胞。
[0119] 技术人员已知，T细胞的扩大通常在适当的T细胞扩大培养基中进行。通常，步骤 a)的方法可在不改变培养基的情况下进行。通常，步骤b)的方法可在不改变培养基的情况 下进行。但是，如果血糖仪指示，例如，即如果系统中的葡萄糖降至l〇〇mg/dl以下，则应改 变培养基。因此，本公开的方法是有效之处在于其最小化扩大T细胞所需的干预量。
[0120] T细胞扩大可通过计数存活⑶3+细胞来评价。
[0121] 可通过细胞染色来测试存活细胞，用例如下列染色：台盼蓝（和光学显微镜）或 7_氨基-放线菌素D，在670nm下放出的活体染料（或ViaProbe，7AAD的商品备用溶液）和 流式细胞术--应用本领域技术人员已知的技术。当染色剂渗透到细胞中时，细胞被认为 是非存活的。不摄取染料的细胞被认为是存活的。示例性方法可利用每约100 UL细胞悬 浮液约5 y L的7AAD和约5 y L的Annexin-V (磷脂结合蛋白，其结合凋亡期间暴露的外部 磷脂磷脂酰丝氨酸）。可在没有光的情况下环境温度下将这种混合物温育约15分钟。然后 可利用流式细胞术进行分析。参见例如，MG Wing, AMP Montgomery, S.Songsivilai and JV Watson. An Improved Method for the Detection of Cell Surface Antigens in Samples of Low Viability using Flow Cytometry. J Immunol Methods 126:21-271990。
[0122] T细胞扩大培养基通常包括相关扩大步骤（即，步骤a)或步骤b))使用的血清、培 养基和任何细胞因子。
[0123] 在一个实施方式中，所用血清是例如15%血清或更少如10%血清，具体地使用人 血清。
[0124] 在一个实施方式中，培养基是高级RPMI或RPMI 1640,可来自Life Technologies。
[0125] 在一个实施方式中，所用细胞因子在下文讨论。
[0126] 在一个实施方式中，细胞扩大培养基包括10 %人AB血清，200mM L-谷氨酰胺， 45%￡&1'16'8他111'8氨基酸伍祖4或(：11〇1^培养基）和45%高级1^]\〇或1^]\〇-1640。
[0127] 在一个实施方式中，所用培养基无需应用血清。
[0128] 本文所用的细胞扩大指代基于细胞分裂增加细胞群中靶细胞的数量。
[0129] 在一个实施方式中，在步骤a)中，用肽/肽混合物直接处理PBMC。非常惊讶的是， 自体PBMC可在肽存在的情况下以类似于自体树突细胞存在时的方式激活T细胞，具体地因 为来自文献的信息是树突细胞是最佳的抗原递呈细胞。Chen ML，Wang冊，Lee PK，LinCM. ImmunolLett. 2001Jan 1 ;75 (2):91-6。
[0130] 在另一实施方式中，在本方法的步骤a)中，使用从患者PBMC制备的树突细胞。
[0131] 血液样品不是普遍要经历最初的细胞物理选择，例如，从单采血液成分术群选择 亚细胞群（或T细胞）。
[0132] 在一个实施方式中，1至2X107PBMC在30ml培养基中的GRex40中细胞因子存在 的情况下用〇. 5至1 X 106肽-脉冲的DC刺激。9至14天培养后，细胞的收集，例如，在50 至80 X 107抗原特异性响应T细胞的范围内。但是，这可在无反应性T细胞的患者体内较 低。
[0133] 如果指示葡萄糖降至100mg/dl以下（在血糖仪上），则培养基（45%高级RPMI、 45% EHAA、10% FCs和200mM L-谷氨酰胺）将被改变。
[0134] 树突细胞通常被本领域技术人员称为专业抗原递呈细胞。该术语指代如下事实： 树突细胞在向T细胞递送两信号激活过程中是最佳的，即，除在细胞表面上递呈抗原外，树 突细胞还提供强共同刺激信号。两种信号，通过抗原递呈刺激和共同刺激，均是实现T细胞 激活所需的。
[0135] 用于本发明方法的树突细胞可通过用肽混合物脉冲（或负载）由患者PBMC样品 生成，其详细内容在下文讨论。
[0136] 本文所用的脉冲或负载意图仅指代在适当培养基中使相关T细胞如PBMC或树突 细胞暴露于肽混合物。
[0137] 用于本方法的树突细胞可如下制备：从患者样品采集PBMC，并将其粘附于塑料。 通常，单核细胞群粘着并且所有其他细胞可被洗脱。然后将粘附群用IL-4和GM-CSF分化， 生成单核细胞衍生的树突细胞。可通过添加IL-1P、IL-6、PGE-1和TNF-a(其上调树突细 胞表面上重要的共同刺激分子）使这些细胞成熟，然后如本文描述用肽混合物转导，以提 供所需的树突细胞。
[0138] 以这种方式生成和成熟化DC的参考可在如下中找到：Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, et al.Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol. 1997 ;27:3135 - 3142。
[0139] 各肽库/混合肽的肽可以1至lOOng肽/15X 106PBMC或ATC(参见下文讨论）或 1至100ng肽每2X 106DC添加。
[0140] 在一个实施方式中，用IL-4和GM-CSF刺激PBMC 3至5天，然后用GM-CSF、IL-4、 TNF-a、IL-lb、PGE-1或PGE-2和IL-6成熟1或2天，然后用所述肽脉冲。
[0141] 因此在一个实施方式中，步骤a)的树突细胞是自体的。
[0142] 在一个实施方式中，产生的树突细胞应答是平衡的⑶4和⑶8应答。
[0143] 本文所用的平衡的CD4和CD8应答意图指代如下事实：CD4细胞或CD8在扩大方法 中不耗尽。但是本文所用的平衡群仍可倾斜，在于CD4细胞可多于CD8细胞，或反之亦然。
[0144] 在一个实施方式中，步骤a)中PBMC与树突细胞的比率在10:1至50:1范围内，例 如、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、如约 20:1。
[0145] 树突细胞提供有效T细胞激活，并且当培养中的抗原特异性T细胞频率低（100T 细胞中小于1可对目标抗原具有特异性）时，例如，在步骤a)中应用树突细胞是有效的。但 是，随着抗原特异性T细胞扩大的数量和频率以及特异性T细胞与树突细胞的比增加，树突 细胞的激活效率降低，除非树突细胞的数量可增加。抗原特异性T细胞将向激活后的树突 细胞频繁递送细胞毒性应答。树突细胞的杀死则将减少可用于继续激活和扩大靶抗原特异 性T细胞的激活信号。
[0146] 虽然树突细胞非常有效地刺激T细胞扩大成对靶抗原具有特异性的群，但其难以 生成大量树突细胞。因此虽然在实践中步骤b)可应用树突细胞，但在步骤b)中应用不同 抗原递呈细胞和人造共同刺激或因子具有优点。在一些实例中，当树突细胞的数量相对于 T细胞过小时，观察不到T细胞激活。这将在下文得到更详细讨论。
[0147] 有利地，认为树突细胞能够激活记忆T细胞和原初T细胞。根据本发明细胞群中 记忆T细胞的存在可能是非常重要的。
[0148] 本文所用的小群意图指代如下事实：小群中细胞的绝对数量显著低于预期群中的 细胞数量，例如，总群的30%或更少。
[0149] 下文描述的肽混合物可用于选自树突细胞脉冲、抗原递呈细胞脉冲的一个或多个 目的，或可与PBMC -起直接用于步骤a)。
[0150] 肽混合物来自相关病毒抗原，例如，EBV病毒抗原。EB病毒，常被称为EBV，是疱疹 病毒家族的成员，并且慢性感染超过95 %的世界人口。
[0151] 在一个实施方式中，肽来自乳头瘤病毒的抗原。
[0152] 在一个实施方式中，肽来自丙肝病毒的抗原。
[0153] 在一个实施方式中，肽来自牛痘病毒（VV)的抗原。
[0154] 在一个实施方式中，肽来自水痘带状疱疹病毒（VZV)的抗原。
[0155] 在一个实施方式中，肽来自人免疫缺陷病毒的抗原。
[0156] 在一个实施方式中，肽来自乙肝、