或在给定步骤开始时伴随添加。后者适用于步骤a)和/或步骤b)。
[0243] 步骤a)和/或步骤b)中外源细胞因子的存在可选地可以贯穿该步骤以部分方式 添加，例如，在步骤开始后1、2、3、4天或更多天。
[0244] 在一个实施方式中，本公开的方法用于提供细胞群，包括CD4+T细胞群，例如，Thl 群。本文所用的AThl群意图指代CD4+群，其中5%的细胞或更多，如10、20、30、40、50、60、 70、80、90%或更多被归类为Thl。
[0245] Thl细胞，除其他功能外，通常最大化巨噬细胞的杀死效力和细胞毒性⑶8+细胞 的增殖。
[0246] 记忆T细胞是Thl细胞的亚类。
[0247] 在一个实施方式中，得自本方法的细胞群包括记忆T细胞的亚群。虽然不希望被 理论束缚，但认为大部分得自本方法的T细胞将衍生自起始群的记忆部分。
[0248]在一个实施方式中，IL-2不用于步骤（a)，因为该细胞因子促进的扩大可能过于 非特异性并且导致NK细胞、具有不需要的功能/特异性的T细胞和可在细胞中生成一定量 无反应性的T调节细胞扩大。因此在一个实施方式中，唯一存在于培养物中的IL-2是内生 IL_2，即，其是被细胞分泌的。
[0249] 在一个实施方式中，IL-2不用于步骤（b)，因为其可比IL-15促进更加分化的表 型。
[0250] 本文所用的无反应性意图指代缺乏细胞对抗原刺激的应答性。无反应性可利用功 能分析来测量，例如，相关细胞群的干扰素Y分泌。与全功能（非-无反应性）细胞相比较 低水平的干扰素Y分泌可指示无反应性程度。当然，细胞的无反应性程度越大，具体（标 记）功能性将越低。
[0251] 如上所述，扩大产物背景下的无反应性意指上位术语，其指代细胞功能以一种或 多种相关方式减少。该术语包括细胞衰竭，例如，其中细胞不再能够分裂。于是，细胞被称 为衰老。细胞停止分裂是因为端粒--复制所需的染色体末端的DNA保护位--随着每次 复制而变短，最终被耗尽。
[0252] 认为H)-l (程序性细胞死亡蛋白1 ;Uniprot Q15116)--在细胞表面上被表达， 是无反应性的标记。在一个实施方式中，小于10%，例如，9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5%或更少 的相关扩大t细胞群表达ro-i，如约1 %。
[0253] 在T细胞高水平无反应性的患者如复发性NPC的患者体内，LMP/EBNA1特异性T细 胞的频率可在ro-Li或ro-i的封闭抗体存在的情况下增加，即，其阻止来自结合受体的配 体的信号传导。
[0254] 这种现象未被发现于健康供体中，这表明2型潜伏抗原特异性T细胞可能在NPC 患者中是无反应性的。
[0255] 本文所用的靶抗原意图指代用于在T细胞中生成对治疗性祀--如具体病毒，例 如，EBV--的特异性的抗原。因此，被靶病毒感染的细胞或癌细胞通常表达靶抗原，因此本 身会变成被免疫系统清除的靶。
[0256] 在一个实施方式中，扩大的T细胞群是平衡⑶4+和⑶8+群，也就是说，细胞群包 括⑶4+和⑶8+细胞，但不必等量。本说明背景下的平衡用于意指群⑶4+或⑶8+其中一 个在扩大过程中不减少（耗尽）。
[0257] 利用本公开的方法扩大的细胞群包括预期的T细胞群，并且通常不仅仅由预期群 组成。给予患者的最终产物可包括多种其他细胞--方法不靶向其扩大。在一个实施方式 中，预期的⑶4+和⑶8+细胞群占总细胞群约60%或更少。细胞群的频率可利用Y-IFN ELISP0T分析或利用Multimer (例如Tetramer)染色测量，二者均是本领域技术人员已知 的。
[0258] 在一个实施方式中，得自该方法的T细胞群在通过光谱分析时是多样的，但无优 势克隆出现。也就是说，起始样品中的T细胞多样性基本上表现在扩大T细胞中，即，扩大 通常不提供单克隆或寡克隆靶细胞群。
[0259] 显著比例--例如，30%至60%的扩大细胞通常表达效应记忆标记，包括⑶27、 CD28、CD62L 和 / 或 CD45R0。
[0260] 预期50%或更多，如60、70、80、90或95%，的根据本公开所述的抗原特异性T细 胞可能够杀死扩大方法中使用的表达抗原的靶细胞。
[0261] 我们认为足够的细胞，甚至患者治疗所需的最高细胞剂量，可利用本公开的双刺 激应用方法来制备--与利用Ad载体和LCL的28至63天LMP-T细胞培养相比，花费16 至24天范围的T细胞培养。
[0262] 此外，通过本发明的方法生成的细胞可具有优势在于，与通过现有技术方法制备 的细胞相比，其更具特异性，生产较高水平的Y干扰素和/或表达较低水平的无反应性标 记。
[0263] 在一个实施方式中，癌症患者的无反应性T细胞可不良生长，并且需要三种刺激。 第三刺激可包括另外的刺激性组分。由于此时大部分细胞应当具有特异性，不存在关于不 需要的细胞的扩大的忧虑。
[0264] 在一个实施方式中，第三刺激培养包括（1)肽脉冲的、辐射后的自体激活T细胞， (2)辐射后的共同刺激的细胞系如aK562细胞，（3)来自血库认可的异源供体的辐射后的 PBMC，和⑷次促有丝分裂剂量的抗⑶3 ;1至100ng/mL，例如，50ng/mL。
[0265] 在一个实施方式中，进行一个或多个测试以建立细胞用于治疗的适应性，例如，干 扰素Y ICS (胞内细胞因子染色）和/或干扰素yELISPOT分析。
[0266] 在一个实施方式中，适应性测试被组合在单次流式细胞术分析中。
[0267] 在一个实施方式中，进行非特异性杀死的51Cr释放分析，但这通常不构成适应性 分析的部分。
[0268] 在一个实施方式中，批释放测试显示在表1中：
【主权项】
1. 体外扩大抗原特异性T细胞如自体抗原特异性T细胞的方法，包括步骤： a) 在存在下列的情况下培养自体PBMC细胞群： i) 已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原（一 种或多种）相关的肽/肽混合物，和 ii) 至少一种细胞因子，和 b) 在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群： i) 已用与靶抗原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗 原（一种或多种）相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞（T-APC's)细胞以及人 造共同刺激因子，和 ii) 任选地，细胞因子，并且 其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗 原的DNA或RNA的使用。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中实施步骤b)两次或更多次（如3、4、5次或更多 次），直到获得足够数量的所述相关T细胞群。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a)的培养进行12天或更少。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤b)的培养步骤进行12天或更 少。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中培养在包括透气性培养表面的容器 中进行。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中扩大的T细胞对EB病毒、牛痘病毒 或水痘带状疱疹病毒抗原或抗原如EBV具有特异性。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的肽包括2和 1000种之间的肽，例如，2至500种肽、2至300种肽或2至100种肽。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的肽重叠，例如， 重叠 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或更多个氨基酸。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤a)和/或b)的肽为约10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度，如15个氨基酸的长度。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中部分a)和/或b)的肽覆盖抗原 LMPl的部分或全长。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中部分a)和/或b)的肽覆盖抗原LMP2的部分或全长。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中部分a)和/或b)的肽覆盖抗原 EBNAl的部分或全长。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中部分a)和/或b)的肽覆盖抗原 BARFl的部分或全长。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤a)中存在的细胞因子是 IL-4〇
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中步骤a)中存在的细胞因子是 IL-7。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤b)中存在的细胞因子是IL-15。
17. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中人造共同刺激因子是工程改造细 胞系，如anaK562细胞，其中一个或多个相关蛋白质或蛋白质片段存在于细胞表面上。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质或蛋白质片段独立地选自CD80、 CD86、CD83、0X-40 配体和 41BB配体。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中全部所述蛋白质或蛋白质片段存在于共同刺激 细胞的表面上。
20. 根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述方法在GRex?系统中进行。
21. 扩大的自体或异源T细胞产物，其可获得自或得自权利要求1至20中任一项所述 的方法。
22. 根据权利要求21所述的扩大的自体或异源T细胞产物，其中与利用病毒载体扩大 并用过表达某些靶抗原的EBV-LCL再刺激的细胞相比，一个或多个靶细胞群具有相当的靶 抗原特异性。
23. 根据权利要求21或22所述的扩大的自体或异源T细胞产物，其中靶细胞群中的 一个或多个在给定时间点的靶抗原特异性高于利用病毒载体扩大并用过表达某些靶抗原 EBV-LCL的再刺激的细胞。
24. 药物组合物，包括权利要求21至23中任一项所述的扩大的T细胞产物，和赋形剂、 载体、稳定剂、表面活性剂或其他非治疗活性组分。
25. 治疗患者如免疫抑制患者的病毒感染或病毒引起的癌症的方法，通过给予适当剂 量的权利要求21至23中任一项所述的扩大的T细胞产物或权利要求24所述的药物组合 物进行。
26. 其上无伴随抗原递呈的工程改造的细胞系如aK562细胞作为人造共同刺激因子在 T细胞如自体T细胞的抗原特异性扩大中的应用。
27. 用抗原-肽/肽混合物脉冲的树突细胞用于抗原特异性T细胞扩大的应用。
28. 用抗原-肽/肽混合物脉冲的T-APC用于抗原特异性T细胞扩大的应用。
29. 抗原-肽混合物与PBMC用于抗原特异性T细胞扩大的应用。
【专利摘要】本公开涉及体外扩大自体或异源抗原特异性T细胞的新方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下培养自体PCMB细胞群：i)已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下培养来自步骤a)的T细胞群：i)已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈T细胞(T-APC’s)细胞，和人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，所述方法在相关T细胞群扩大中不采用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的DNA或RNA或重组靶抗原的使用。本公开还扩展至得自所述方法的细胞群、包括所述细胞群的药物组合物和细胞和组合物的治疗用途，特别是治疗或预防病毒感染和/或癌症，例如，在免疫抑制或免疫活性患者体内。
【IPC分类】A61K35-17, C12N5-0783
【公开号】CN104769104
【申请号】CN201280069568
【发明人】C·M·鲁尼, A·M·利恩, J·F·维拉, M·V·尼高, R·L·库纳斯
【申请人】细胞药物有限公司, 贝勒医学院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2012年4月23日
【公告号】EP2791322A1, US20150017723, WO2013088114A1