用于治疗、预防或缓解疼痛的融合蛋白和方法
【专利说明】用于治疗、预防或缓解疼痛的融合蛋白和方法
[0001] 本发明涉及非细胞毒性融合蛋白及其作为止痛分子的治疗性应用。
[0002] 根据毒素对目标分子的作用类型，通常可将毒素分为两组。具体而言，第一组毒素 杀死其天然目标细胞并因此称为细胞毒性毒素分子。该组毒素的示例包括植物毒素（如蓖 麻毒蛋白和相思豆毒蛋白）和细菌毒素（如白喉毒素和假单胞菌外毒素A)。细胞毒性毒素 受到了用于治疗细胞疾病和病症（如癌症）的"魔术弹"设计（例如免疫偶联物，其包含细 胞毒性毒素组分和结合目标细胞上特定标记的抗体）的大量关注。细胞毒性毒素通常通过 抑制细胞的蛋白合成过程杀死其目标细胞。
[0003] 第二组毒素称为非细胞毒性毒素，顾名思义，这类毒素不会杀死其天然目标细胞。 与细胞毒性毒素相比，非细胞毒性毒素受到的商业关注较少，并通过抑制除蛋白合成以外 的细胞过程来发挥其对目标细胞的作用。非细胞毒性毒素由多种植物和多种微生物（梭菌 属（Clostridiumsp.)和奈瑟球菌属（Neisseriasp.))产生。
[0004] 梭菌神经毒素是通常具有150kDa分子量的蛋白。其由多种细菌生产，特别是属于 梭菌属的细菌，最重要的是破伤风梭菌（C.tetani)和肉毒梭菌（C.botulinum)、丁酸梭菌 (C.butyricum)和阿根廷梭菌（C.argentinense)的几种菌株。存在8种不同类型的梭菌神 经毒素，即破伤风毒素，和肉毒菌神经毒素的血清型A、B、Cl、D、E、F和G，且其都共有类似 的结构和作用模式。
[0005] 梭菌神经毒素代表非细胞毒性毒素分子的主要组且由宿主细菌以单个多肽的形 式合成，所述多肽通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰以形成由二硫键连接在一起的两 条多肽链。这两条链被称为重链（H链，其分子量为约lOOkDa)和轻链（L链或LC，其分子量 为约 50kDa)。
[0006]L链具有蛋白酶功能（锌依赖的内肽酶活性）并对胞吐过程中涉及的囊泡和/或 质膜相关蛋白表现出高底物特异性。来自不同梭菌物种或血清型的L链可水解三种底物蛋 白（即突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25)之一中不同但特定的肽键。这些底物是神 经分泌机制的重要组分。
[0007] 奈瑟球菌属（最重要地，来自淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae)物种）生成功能 类似的非细胞毒性蛋白酶。这类蛋白酶的示例是IgA蛋白酶（参见W099/58571)。
[0008] 本领域中已充分证明，毒素分子可再次靶向不是该毒素天然目标细胞的细胞。再 次靶向时，修饰的毒素能够结合所需目标细胞，随后易位至细胞溶质，能够对目标细胞发挥 作用。所述再次靶向是通过使用不同的靶向部分（TM)代替毒素的天然TM来实现的。关于 这一点，对TM进行选择使其结合所需目标细胞，并随后使修饰的毒素进入目标细胞内的内 体。修饰的毒素也包含易位结构域以使非细胞毒性蛋白酶进入细胞溶质。该易位结构域可 以是毒素的天然易位结构域或者起可以是获自具有易位活性的微生物蛋白的不同的易位 结构域。
[0009] 可通过本领域技术人员熟知的常规化学偶联技术实现上述TM替换。关于这一 点，参见Hermanson，G.T. (1996)，Bioconjugatetechniques(《生物偶联技术》），学术出 版社（AcademicPress)和Wong,S.S. (1991)，Chemistryofproteinconjugationand cross-linking(《蛋白偶联和交联的化学》），CRC出版社（CRCPress)。或者，可使用重组 技术，如W098/07864中所述的那些。所有上述参考文献均通过引用纳入本文。
[0010] 疼痛传感细胞具有大量受体类型。然而，不是所有的受体类型都适用于（至少是 可用于）受体介导的胞吞。类似地，对于同一受体，不同TM之间的结合特性可广泛变化，这 在不同TM和不同受体之间更为显著。
[0011] 因此，需要研发能够解决一种或多种上述问题的修饰的非细胞毒性融合蛋白。特 别感兴趣的是研发用于治疗疼痛的替代性/改良的非细胞毒性融合蛋白。
[0012] 本发明试图通过提供独特的融合蛋白解决一种或多种上述问题。
[0013] 本方面通过提供单链、多肽融合蛋白解决了一种或多种上述问题，包括：
[0014]a.非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器 (exocyticfusionapparatus)的蛋白；
[0015]b.结合伤害性感觉传入神经上结合位点的甘丙肽靶向部分，该结合位点胞吞整合 入伤害性感觉传入神经内的内体；
[0016]c.蛋白酶切割位点，融合蛋白在该位点处被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位点位 于非细胞毒性蛋白酶和甘丙肽靶向部分之间；
[0017]d.易位结构域，其将蛋白酶从内体内跨内体膜移至伤害性感觉传入神经的细胞溶 质中，其中靶向部分位于蛋白酶切割位点和易位结构域之间；
[0018]e.位于非细胞毒性和蛋白酶切割位点之间的第一间隔子，所述第一间隔子包含4 至25个氨基酸残基的氨基酸序列；
[0019]f.位于甘丙肽靶向部分和易位结构域之间的第二间隔子，所述第二间隔子包含4 至35个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0020] 本发明的非细胞毒性蛋白酶组分是非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够切割伤害性 感觉传入神经的胞吐融合器的三种底物蛋白（即突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25) 之一中不同但特定的肽键。这些底物是神经分泌机制的重要组分。优选地，本发明的非细 胞毒性蛋白酶组分是奈瑟球菌IgA蛋白酶或梭菌神经毒素L链。术语非细胞毒性蛋白酶包 括所述非细胞毒性蛋白酶的功能等同的片段和衍生物。特别优选的非细胞毒性蛋白酶组分 是肉毒杆菌神经毒素（BoNT)L链。
[0021] 本发明的易位组分能够使非细胞毒性蛋白酶（或其片段）易位至目标细胞中，从 而在目标细胞的细胞溶质中发生蛋白酶活性的功能性表达。该易位组分优选能够在低pH条件下在脂膜中形成离子可渗透孔。优选地，已发现仅使用蛋白分子中能够在内体膜内形 成孔的那些部分。该易位组分可获自微生物蛋白来源，特别是获自细菌或病毒蛋白来源。因 此，在一个实施方式中，该易位组分是酶（如细菌毒素或病毒蛋白）的易位结构域。本发明 的易位组分优选是梭菌神经毒素H链或其片段。更优选地，其是HN结构域（或其功能性组 分），其中馬表不梭菌神经毒素H链大致相对于H链的氨基端一半的一部分或片段，或者完 整的H链中对应于该片段的结构域。
[0022] 本发明的甘丙肽TM组分负责使本发明的融合蛋白结合目标细胞上的结合位点。 因此，该甘丙肽TM组分是一种配体，本发明的融合蛋白通过其结合经选择的目标细胞。
[0023] 在本发明的上下文中，该目标细胞是伤害性感觉传入神经，优选初级伤害性传入 神经（例如A纤维（如AS纤维）或C纤维）。因此，本发明的融合蛋白能够抑制神经递 质或神经调节因子[例如谷氨酸、底物P、降钙素基因相关肽（CGRP)和/或神经肽Y]从离 散的伤害性感觉传入神经元群体中释放。使用中，该融合蛋白减少或阻止了感觉传入信号 (如神经递质或神经调节因子）从外周至中枢疼痛纤维的传递，并因此可用作治疗疼痛（特 别是慢性疼痛）的治疗性分子。
[0024] 确定TM与伤害性感觉传入神经结合是常规的。例如，可使用简单的放射性替换 实验，其中代表伤害性感觉传入神经的组织或细胞（例如DRG)在过量的未经标记配体存 在的情况下接触经标记（如氚化）的配体。在这种实验中，可评估非特异性和特异性结合 的相对比例，从而确定配体结合伤害性感觉传入神经目标细胞。任选地，该试验可包括一 种或多种结合拮抗剂，且该试验还可包括观察配体结合的损失。这类实验的示例可参见 Hulme，E.C. (1990)，Receptor-bindingstudies,abriefoutline(《受体结合研宄概要》）， 第 303-311 页，Receptorbiochemistry,APracticalApproach(《受体生物化学，实践方 法》），E.C.Hulme编，牛津大学出版社（OxfordUniversityPress) 〇
[0025] 与对应的"游离"TM(如gall6)相比，本发明的融合蛋白通常显示降低的对甘丙 肽受体（例如，GALR1)的结合亲和性（在最多10倍的范围内）。然而，虽然存在这项观察， 但本发明的融合蛋白出乎意料的显示了良好的效力。这可归因于两个主要特性。首先，非 细胞毒性蛋白酶是催化性的一一因此少量这类分子的治疗性作用被迅速扩大。其次，伤害 性感觉传入神经上存在的甘丙肽受体仅需作为治疗剂进入的通道，而无需被刺激至所需水 平以实现配体-受体介导的药理反应。因此，本发明的融合蛋白可以比其他类型的止痛分 子（如NSAIDS、吗啡和加巴喷丁）低得多的剂量给予。后几种分子通常以较高的微克至毫 克（甚至数百毫克）的量给予，而本发明的融合蛋白可以低得多的剂量给予，通常至少低10 倍，且更通常低100倍。
[0026] 本发明的甘丙肽TM也可以作为伤害性感觉传入神经（更具体是初级伤害性传入 神经）上存在的一个或多个甘丙肽受体的"激动剂"。通常，激动剂被认为是能够增加或降 低细胞内活性的任何分子，即简单地引起细胞活性变化的任何分子。例如，激动剂的常规含 义可包括能够与细胞上受体合并并起始反应或活性的化学物质，或者通过活化受体诱导活 性应答（无论该应答是增加还是降低细胞活性）的药物。
[0027] 然而，对于本发明的目的，激动剂可更具体地定义为能够刺激目标细胞中胞吐融 合过程的分子，该过程易于被能够切割所述目标细胞中胞吐融合器蛋白的蛋白酶（或其片 段）抑制。
[0028]因此，本发明的特定的激动剂定义排除了许多常规情况下被认为是激动剂的分 子。例如，神经生长因子（NGF)是一种激动剂，其能够通过结合TrkA受体促进神经元分化。 然而，根据上述标准评价时NGF不是一种激动剂，因为其不是胞吐融合的主要诱导因子。此 外，NGF刺激的过程（即细胞分化）不易于被非细胞毒性毒素分子的蛋白酶活性抑制。
[0029] 在一个实施方式中，本发明的融合蛋白显示优先结合受体和/或内化特性。这转 而导致蛋白酶组分更高效地递送至疼痛感觉目标细胞。
[0030]由于副作用的存在，使用激动剂作为TM是自限制的。更具体地，激动剂TM与疼痛 感觉目标细胞的结合增加了胞吐融合，其可能恶化疼痛感觉。然而，由激动剂结合刺激的胞 吐过程随后被融合蛋白的蛋白酶组分降低或抑制。
[0031] 可使用实施例9所述的方法确定TM结合伤害性传入神经上受体的激动剂特性。
[0032] 本发明的靶向部分包