低温下β-葡萄糖苷酶活性增强的多肽的制作方法
【专利说明】低温下葡萄糖苷酶活性增强的多肽
[0001] 由于大量原料的可利用性和对乙醇作为燃料的兴趣，用纤维素生产乙醇的可能性 已经得到很大的关注。用于这类工艺的基于纤维素的天然原料被称为"生物质"。已经将许 多类型的生物质，例如木材、农业废弃物、草本作物和城市固体垃圾，考虑作为生产生物燃 料的潜在原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。
[0002] 纤维素是由e -1，4键连接的葡萄糖分子组成的聚合物，其对降解或解聚合非常 有耐性。一旦纤维素被转化为葡萄糖，后者容易用酵母发酵成生物燃料，如乙醇。
[0003]研宄的用于将纤维素转化为葡萄糖的最古老的方法是基于酸水解。该工艺可以在 浓酸或稀酸的存在下进行。然而，几个缺点（例如当使用浓酸时酸回收很少，以及使用稀酸 的情况下葡萄糖的产量低）对于酸水解工艺的经济性是不利的。
[0004] 为了克服酸水解工艺的缺点，最近的纤维素转化工艺已经更多地与酶促水解（使 用纤维素酶类型的酶）相关。然而，该木质纤维素生物质（如纤维素）的酶促水解的缺点 是其工业生产方法较为昂贵。因此，有必要使用越来越有效的分泌纤维素酶的微生物菌株。 在这方面，很多微生物包含水解纤维素的酶，例如真菌-木霉属（Trichoderma)、黑曲霉属 (Aspergillus)、腐质霉属（Humicola)、或镰刀菌属（Fusarium)，以及细菌例如高温单孢菌 属（Thermomonospora)、芽抱杆菌属（Bacillus)、纤维单胞菌属（Cellulomonas)和链霉菌 属（Str印tomyces)。由这些微生物分泌的酶具有用于将纤维素转化为葡萄糖的三种类型的 活性，分为三组：随机攻击纤维素纤维内部的内切葡聚糖酶，攻击纤维末端释放纤维二糖的 外切葡聚糖酶，和将该纤维二糖水解为葡萄糖的葡萄糖苷酶。后者构成了纤维素转化 过程的限制性步骤。实际上，该过程的第一个难题是纤维二糖到葡萄糖的转化，因为在生物 燃料的生产过程中，任何在该过程最后没有被水解的纤维二糖代表了产量的损失。
[0005]考虑到一些生产纤维素酶的微生物（包括木霉属）产生非常少的0 _葡萄糖苷 酶，纤维二糖的积累是酶促水解的一个主要问题。实际上，由工业木霉属菌株分泌的总蛋白 的不到1%是葡萄糖苷酶类型。因此，这样少量的葡萄糖苷酶导致了将纤维二糖水 解为葡萄糖的低容量，从而造成在系统中纤维二糖的积累。高浓度的纤维二糖碰巧抑制其 他纤维素酶，尤其是抑制其反应终产物是纤维二糖的外切葡聚糖酶的活性。为了克服这些 缺点，发明人在他们的专利申请W02010/029259中开发了 葡萄糖苷酶基因使其能够获 得具有增加的比活性的酶，从而大幅度改进将木质纤维素生物质转化为生物燃料的工艺。
[0006] 水解和发酵可以根据各种方案进行。最常见的由独立的水解和发酵（SHF)组成。 该方法能够通过维持最佳反应条件来优化各个步骤。发酵在约28°C至约30°C之间的温度 即时进行，而水解一般在至少45°C的温度进行。然而，在SHF中，在反应最后释放的糖浓度 非常高，导致对酶的抑制，降低了该方法的效率。
[0007] 为了避免这些缺点，可以设想另一种方法（SSF-同时糖化和发酵）。在SSF中，两 个步骤（己糖的水解和发酵）同时发生，防止糖积累到抑制酶的浓度。使用单一反应器后， 投资成本也降低了。由于没有抑制，之后水解度就提高了，因为释放的糖立即被用于发酵成 乙醇。
[0008]在该方法中，反应器的温度必然由水解和发酵的最佳温度之间的平衡构成，一般 在约30°C至约35°C之间。然而，纤维素分解酶（包括葡萄糖苷酶）的活性在该温度被 降低了约30%。
[0009] 因此，需要在SSF方法的最佳水解和发酵温度下，尤其是在约30°C至约35°C之间 的温度下能够保持有效的葡萄糖苷酶活性的酶。
[0010] 发明人已经开发了在约30°c至约35°C之间的温度下具有增强的e-葡萄糖苷酶 活性的多肽，尤其是与野生型BGL1蛋白（序列SEQIDN0 :3)的葡萄糖苷酶活性相比。 BGL1是来自里氏木霉（Trichodermareesei)的0-葡萄糖苷酶。
[0011] 发明人之前已经鉴定出与野生型BGL1蛋白的葡萄糖苷酶活性相比具有增强 的特异性0 _葡萄糖苷酶活性的几个克隆。该结果展示于他们的专利申请W02010/029259 中。更具体地，他们已经说明了编码SEQIDN0:5的多肽的一个具体克隆（称为100B11)， 在里氏木霉中该克隆在强启动子控制下的表达导致了产生的酶鸡尾酒与由没有表达 该酶的菌株产生的酶鸡尾酒相比，其葡萄糖苷酶活性提高了 26.2倍（专利申请 W02010/029259 表 6)。
[0012] 令人惊讶且出乎意料地，他们现在说明了一个与之前鉴定的克隆100B11相比，编 码具有增强活性的酶的新克隆，这是在约30°C至约35°C之间的温度。
[0013] 因此，本发明涉及具有e-葡萄糖苷酶活性的具有氨基酸序列SEQIDN0 :1的多 肽。
[0014] 本发明的多肽的氨基酸序列如下：
[0015]MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWN GGPCVGNTSPASKIGYPQLCLQDGPLGIRFGGSVTAFTPGIQAASTWDTELMRQRGEYLGAEAKGCGIHVLLGPVAG PLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMAETIEGLQSAGVQACAKHYIVNEQELNRETISSNPDDRTLHELYLWPFADA VHANVASVMCSYNKINGSWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGP ALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANILPLKKP ASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGAS AARGKDVAIVFITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVVHSVGAIILEQILALPQVKAV VWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGKLVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGYGL SYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIANSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGF AKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWWPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVA。
[0016] 该多肽由核酸序列SEQIDN0 :2编码。
[0017] 优选地，具有氨基酸序列SEQIDN0 :1的该多肽在约30°C至约35°C之间的温度具 有增强的葡萄糖苷酶活性，尤其是与在这些相同温度下的具有序列SEQIDN0 :3的野 生型BGL1蛋白的0 -葡萄糖苷酶活性相比。BGL1蛋白由核酸序列SEQIDN0 :4编码。
[0018] 更优选地，具有氨基酸序列SEQIDN0 :1的该多肽在约30°C至约35°C之间的温度 与在相同温度下的具有氨基酸序列SEQIDN0 :5的100B11多肽的葡萄糖苷酶活性相 比具有增强的0 -葡萄糖苷酶活性。100B11多肽由核酸序列SEQIDN0 :6编码。
[0019] 此外，根据本发明的多肽具有对葡萄糖的抑制不太敏感的优点，因此在高葡萄糖 浓度存在下保留更好的葡萄糖苷酶活性。
[0020] 在一个实施方案中，如之前所述的多肽在葡萄糖存在下测定的葡萄糖苷酶活 性与野生型蛋白BGL1(SEQIDN0 :3)在没有葡萄糖时测定的葡萄糖苷酶活性相比增 强。
[0021] 在一个优选的实施方案中，与具有氨基酸序列SEQIDNO:5的100B11多肽的 0 _葡萄糖苷酶活性相比，本发明的多肽在约30°C至约35°C之间的温度下的0 -葡萄糖苷 酶活性增强至少10 %、优选增强至少20 %、优选增强至少30 %、甚至更优选增强至少40 %。
[0022] 例如，本领域技术人员能够通过酶活性测试手段使用底物对硝基苯基-D-葡 萄糖苷（PNPG)确定根据本发明的多肽的酶活性的增加或换句话说改进。在葡萄糖苷 酶作用后所得的对硝基苯酚的量可以，例如，通过读取414nm的光学密度来确定。
[0023] 本领域技术人员可以用来确定根据本发明的多肽与野生型BGL1蛋白相比是否具 有增强的酶活性的方案的实例如下：
[0024]-制备表达根据本发明的多肽的大肠杆菌（E.coli)的原种培养物，在37°C过 夜；
[0025]-于20°C用1 %的原种培养物接种LB培养基24小时；
[0026] -在13000rpm下离心2分钟；
[0027]-用pH5的100mM琥珀酸盐缓冲液重新悬浮细胞沉淀（最终0D6QQ= 100);
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