使用来自埃默森篮状菌(TALAROMYCES EMERSONII)的α-淀粉酶进行糖化的方法
【专利说明】使用来自埃默森篮状菌（TALAROMYCESEMERSONM)的a-淀粉酶进行糖化的方法
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月10日提交的国际专利申请PCT/CN2012/082699的权益， 该国际专利申请的内容据此以引用方式整体并入本文。
[0003] 序列表
[0004]附件是包括SEQ ID N0 :1-14的序列表，其以引用方式整体并入本文。
技术领域
[0005] 使用来自埃默森篮状菌的a -淀粉酶（TeAmyl)或其变体的方法包括将淀粉糖化， 例如，同步糖化发酵（SSF)。
【背景技术】
[0006] 淀粉由直链淀粉（15-30% w/w)和支链淀粉（70-85% w/w)的混合物组成。直链 淀粉由a-1，4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量（MW)为约60, 000至约800, 000。支 链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有a-1，6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。
[0007] 浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，所述方法涉及：（1) 用a -淀粉酶将固体淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度为约10-12的糊精，以及（2) 用淀粉葡糖苷酶（也称为葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所 得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖 浆（isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可用微生物（诸如酵母）发酵以产 生商品，包括例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、其他 有机酸、其他氨基酸和其他生物化学物质。可同时进行发酵和糖化（即SSF工艺）来实现 更大的经济性和效率。
[0008] a -淀粉酶通过随机裂解内部a -1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。特别 是来自芽孢杆菌属（Bacilli)的a-淀粉酶已被用于多种不同的用途，包括淀粉液化和糖 化、纺织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、食品工业的糖浆的生产、发酵 工艺的原料的生产，以及用于动物饲料中以提高可消化性。这些酶也可用于在盘碟洗涤和 衣物洗涤过程中除去淀粉污垢和污渍。
[0009] 已经从嗜热真菌埃默森篮状菌CBS 814. 70中分离出了 a-淀粉酶。Bunni et al. (1989)Enz.Microb.Technol. 11 :370-75(Bunni 等人，1989 年，《酶与微生物技术》，第 11 卷，第370-375页）。编码a-淀粉酶的CDNA在大肠杆菌（Escherichia coli)中克隆和表 达。Bunni et al. (1992)Biotechnol.Lett.l4(12) :1109_14(Bunni 等人，1992 年，《生物技 术快报》，第14卷，第12期，第1109-1114页）。
【发明内容】
[0010] 来自埃默森篮状菌的a -淀粉酶（TeAmyl ;SEQ ID N0 :1)及其变体在酸性pH下催 化糖化较长的时间。提供编码核酸和表达多核苷酸的宿主细胞。TeAmyl具有酸性工作范 围，并且在同步糖化发酵（SSF)中有助于高乙醇产率和低残余淀粉，例如，特别是当与葡糖 淀粉酶一起使用时。TeAmyl在高温和低pH下表现出高活性，所以在存在真菌葡糖淀粉酶诸 如黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶（AnGA)的情况下可在糖化工艺中有效地使用。 TeAmyl与白曲霉（Aspergillus kawachii) a -淀粉酶（AkAA)催化的糖化产物相比，有利地 催化淀粉糖化为显著富含DP2(即，麦芽糖）的低聚糖组合物。TeAmyl能够以比AkAA低的 剂量使用，以生成与其相当水平的乙醇。
[0011] TeAmyl可以与源自植物（例如，谷物和谷粒）的酶结合使用。TeAmyl还可以与宿 主细胞分泌或宿主细胞内源的酶结合使用。例如，TeAmyl可被添加到发酵或SSF工艺，在 所述工艺期间一种或多种淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化还原酶、 转移酶或其他酶由生产宿主分泌。TeAmyl也可以与内源性非分泌型或分泌型生产宿主酶共 同起作用。在另一个例子中，在发酵或SSF期间TeAmyl可与其他酶一起由生产宿主细胞分 泌。TeAmyl还可以有效地直接水解淀粉得到糖浆以及/或者生产生物燃料、有机酸、氨基 酸和其他生物化学物质（例如，乙醇、柠檬酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖 酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-S -内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸、《 3脂肪酸、 丁醇、异戊二烯、1，3_丙二醇和生物柴油），其中反应温度低于底物的糊化温度。在发酵或 SSF期间TeAmyl可与其他酶一起由宿主细胞分泌。
[0012] 因此，提供了一种糖化包含淀粉的组合物以制备包含葡萄糖的组合物的方法，其 中所述方法可包括：（i)使包含淀粉的组合物与分离的TeAmyl或其变体接触，所述变体具 有a -淀粉酶活性，并且所述分离的TeAmyl或其变体包含与（a) SEQ ID N0 :1的第1-603 位残基或（b)SEQ ID NO :1的第1-476位残基具有至少80 %的氨基酸序列同一性的氨基 酸序列；以及（ii)糖化该包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物；其中所述分离的 TeAmyl或其变体催化淀粉组合物糖化为葡萄糖。
[0013] 为了在相同的条件下减少相同数量的DP3+，TeAmyl或其变体的剂量可以为AkAA 剂量的约17% -50%，或任选地约17% -34%。
[0014] 当以总DP1-DP7的重量百分比测量时，与由AkAA在相同条件下生成的包含葡萄糖 的第二组合物相比，包含葡萄糖的所述组合物可富含DP2或（DP1+DP2)。DP2可在约2小时 时富集2至3倍。此外，（DP1+DP2)可在约2小时时富集约1. 9倍。
[0015] TeAmyl或其变体可包含与（a) SEQ ID N0 :1的第1至603位残基或（b)SEQ ID NO :1的第1至467位残基具有至少90%、95%或99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。 TeAmyl或其变体还可包含（a) SEQ ID N0 :1的第1至603位残基或（b)SEQ ID N0 :1的第 1至476位残基。TeAmyl或其变体可由与（a) SEQ ID NO :1的第1至603位残基或（b) SEQ ID NO :1的第1至476位残基具有至少80%、90%、95%或99%的氨基酸序列同一性的氨基 酸序列组成。TeAmyl或其变体还可由（a) SEQ ID N0 :1的第1至603位残基或（b)SEQ ID NO :1的第1至476位残基组成。
[0016] 淀粉组合物可包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。糖化可在约30°C至约75°C的 温度范围内进行。所述温度范围还可为551：-741：。糖化可在口112.〇1117.5的口11范围 内进行。所述pH范围还可为pH 3. 0_pH 5. 8。所述pH范围还可为pH 3. 5_pH 4. 5。
[0017] 所述方法还可包括发酵葡萄糖组合物以生产发酵最终（EOF)产物。发酵可以是同 步糖化发酵（SSF)反应。发酵可在pH 2-8下并且在25°C-70°C的温度范围内进行48-70 小时。EOF产物可包含8%-18% (v/v)的乙醇。EOF产物可包含代谢物。所述代谢物可以 是有机酸、氨基酸、生物燃料和其他生物化学物质，包括但不限于乙醇、柠檬酸、琥珀酸、谷 氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-S -内酯、 异抗坏血酸钠、赖氨酸、w3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1，3_丙二醇和生物柴油。
[0018]还提供了 TeAmyl或其变体在制备发酵饮料中的用途，以及制备发酵饮料的方法， 所述方法可包括：使醪液和/或麦芽汁与TeAmyl或其变体接触。一种制备发酵饮料的方 法，可包括：(a)制备醪液；(b)过滤所述醪液以得到麦芽汁；以及（c)发酵麦芽汁以获得发 酵饮料，其中TeAmyl或其变体被添加至：（i)步骤（a)的醪液和/或（ii)步骤（b)的麦芽 汁和/或（iii)步骤（c)的麦芽汁。还提供了由所公开的方法生产的发酵饮料。
[0019]发酵饮料或发酵最终产物可选自啤酒，所述啤酒选自例如完全加麦曲啤酒、根据 "纯净法（Reinheitsgebot) "酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒（IPA)、拉格啤酒、苦啤酒、 低麦芽啤酒（Happoshu)(第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡 路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒（stout)、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒； 或谷物或麦芽饮料，例如水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。
[0020] 该方法还可包括向淀粉组合物添加葡糖淀粉酶、海藻糖酶、异淀粉酶、己糖激酶、 木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、0 -淀粉酶、非TeAmyl 的a -淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、 果胶酶、a -葡糖苷酶、0 -葡糖苷酶、裂解酶或其他水解酶、分支酶，或它们的组合。参见例 如TO 2009/099783。葡糖淀粉酶可被添加至0.1-2个葡糖淀粉酶单位（GAU)/g干固形物。
[0021] 分离的TeAmyl或其变体可由宿主细胞表达和分泌。淀粉组合物可与宿主细胞接 触。宿主细胞还可表达和分泌葡糖淀粉酶。宿主细胞还能够发酵葡萄糖组合物。
[0022] 因此，提供了一种用于糖化包含淀粉的组合物的组合物，该组合物可以包含分离 的TeAmyl或其变体，所述分离的TeAmyl或其变体具有a-淀粉酶活性并包含与（ a) SEQ ID N0:1的第1-603位残基或（b)SEQ ID NO: 1的第1-476位残基具有至少80%、90%、95%、 99%或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。TeAmyl或其变体可由与（a)SEQ ID N0: 1的第1-594位残基或（b) SEQ ID NO: 1的第1-476位残基具有至少80 %、90 %、95 %、99 % 或100 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
[0023] 所述组合物可以是培养的细胞材料。所述组合物还可以包含葡糖淀粉酶。TeAmyl 或其变体还可以是经纯化的。
[0024] TeAmyl或其变体可由宿主细胞表达和分泌。宿主细胞可以是丝状真菌细胞、细菌 细胞、酵母细胞、植物细胞、海藻或藻类细胞。宿主细胞可以是曲霉属（Aspergillus)物种、 篮状菌属（Talaromyces)物种、或里氏木霉（Trichoderma reesei)细胞。
[0025] 因此，提供了一种烘焙方法，包括将烘焙组合物添加到待烘焙的物质中，随后烘焙 所述物质以制备烘焙产品，其中所述烘焙组合物包含分离的TeAmyl或其变体，所述变体具 有a -淀粉酶活性，并且所述分离的TeAmyl或其变体包含与（a) SEQ ID N0 :1的第1-603 位残基或（b) SEQ ID NO: 1的第1-476位残基具有至少80%、90%、95%、99 %或100 %的氨 基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述分离的TeAmyl或其变体催化物质中存在的淀粉 组分的水解，以生成较小的淀粉衍生分子。TeAmyl或其变体可由与（a) SEQ ID N0 :1的第1 至603位残基或（b)SEQ ID N0:1的第1至476位残基具有至少80%、90%、95%、99%或 100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。烘焙组合物还可以包含粉（flour)、抗老化 淀粉酶、磷脂酶和/或磷脂。
[0026] 因此，还提供了一种制备食品组合物的方法，包括将以下物质混合：（i) 一种或多 种食品成分，和（ii)分离的TeAmyl或其变体，所述变体具有a-淀粉酶活性，并且所述分 离的TeAmyl或其变体包含与（a)SEQ ID N0 :1的第1-603位残基或（b)SEQ ID N0 :1的第 1-476位残基具有至少80 %、90 %、95 %、99 %或100 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列， 其中所述分离的TeAmyl或其变体催化食品成分中存在的淀粉组分的水解，以生成葡萄糖。 TeAmyl或其变体可由与（a) SEQ ID N0 :1的第1至603位残基或（b)SEQ ID N0 :1的第1 至476位残基具有至少80 %、90%、95 %、99%或100 %的氨基酸序列同一性的氨基