用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法
【专利说明】用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及核酸扩增的领域，特别是使用聚合酶链反应以扩增核酸。本发明提供 方法和试剂盒，其可用于按如下扩增核酸：将FTA?Elute固体支持物与PCR试剂组合用于 核酸样品的一步法扩增。本发明在核酸的长期储存和便于加工中具有应用并且尤其在基因 分型、诊断学和法医学中是有用的。
[0002] 背景 聚合酶链反应（PCR)是在分子生物学中用于扩增核酸的常用工具。US4683202 (Mullis,CetusCorporation)描述了用于扩增包含于核酸或其混合物中的任何所需的特 定核酸序列的方法。
[0003] 在滤纸或化学改性的基质上的核酸的长期储存、转移和存档是用于在将DNA或 RNA以用于遗传分析（例如PCR)的形式提取和分离之前保藏遗传材料的周知的技术。因 此，EP1563091 (Smith等人，Whatman)涉及用于储存来自样品（例如细胞或细胞裂解物） 的核酸的方法。将核酸分离并在室内温度和湿度下，在种类广泛的滤器和其它类型的固体 支持物或固相介质上长时间储存。此外，该文件描述了用于在管、柱或多孔板中的宽泛范围 的固体支持基质上储存含核酸的样品的方法。
[0004]W0/9003959(Burgoyne)描述了用于储存DNA(包括血液DNA)的基于纤维素的固 体支持物，其包括具有化合物或组合物的固体基质，所述化合物或组合物保护掺入基质中 或吸收到基质上的DNA免于降解。此文件也公开了用于使用固体介质储存DNA和用于DNA 的回收或DNA的原位使用的方法。
[0005]US5496562(Burgoyne)描述了用于DNA储存的基于纤维素的固体介质和方法。公 开了用于将DNA存储和转移至固体介质上的方法和涉及（a)从固体介质中回收DNA或（b) 原位在固体介质上使用DNA(例如，通过PCR的DNA序列扩增）的方法。不幸的是，所描述 的方法仅将表面活性剂或去垢剂掺入至固体介质的表面上并因此受累于缺点：它们需要分 离步骤用于在实施PCR之前除去去垢剂。
[0006]W0993900 (Gentra)也描述了用于加工和扩增DNA的方法。该方法包括将含DNA 的样品与固体支持物接触的步骤，其中裂解试剂被结合至固体支持物。随后将所述DNA用 DNA纯化试剂处理并纯化。该申请在固体支持物上不包含多价螯合剂并且需要分离步骤用 于在扩增之前除去裂解试剂和纯化DNA。
[0007] W09639813 (Burgoyne)描述了用于储存遗传材料的样品和随后的分析的固体介 质；所述固体介质包含蛋白变性剂和螯合剂。所述方法是关于螯合剂的，所述螯合剂为任何 能够络合多价离子（其包括II族和III族多价金属离子和过度金属离子）的化合物。该发明 并没有具体提及环糊精作为螯合剂，它也并没提出可按一步法实施PCR分析。
[0008]US5705345 (Lundin等人）描述核酸制备的方法，其中将含细胞样品裂解以释放 核酸并且用环糊精处理该样品以中和提取剂。此系统的优点是：传统去垢剂的去除需要分 离步骤，但在加入环糊精中和去垢剂的情况下会除去了所需的分离步骤并减少了污染的机 会。
[0009] GB2346370(CambridgeMolecularTechnologiesLtd)描述了将包含细胞（其含 核酸）的样品应用至滤器上，所述细胞被滤器保留而污染并没被保留。将所述细胞在滤器 上裂解并与核酸一起保留。后续步骤渗除细胞裂解物同时保留核酸。
[0010] W09618731 (Deggerdal)描述了分离核酸的方法，其中将所述样品结合至固体支 持物上并且将样品与去垢剂接触并实施后续步骤以分离核酸。
[0011] W00053807 (Smith,Whatman)描述了用于储存和裂解含遗传材料（其可被洗提和 分析）的样品的介质。所述介质用裂解试剂涂层。此外，所述介质可用弱碱、螯合剂、表面 活性剂和任选尿酸涂层。
[0012] W09938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述带有结合的裂解试剂的固体支 持物。所述裂解试剂可包含去垢剂、螯合剂、水和任选RNA消化酶。所述固体支持物并不含 环糊精并且需要另外的步骤用于纯化用于扩增分析的核酸。
[0013] 当前用于DNA扩增的方法包括DNA纯化步骤，其常常包括几个步骤，这增加了污染 的机会。这是烦人的过程而且现有技术方法具有在花费、复杂性以及特别是用户时间方面 的多个明显缺点。例如，基于柱的核酸纯化是用以纯化核酸的典型的固相提取方法。此方 法依赖于通过对二氧化硅或其它支持物的吸附（其取决于缓冲液的pH和盐含量）的核酸 结合。合适的缓冲液的实例包括Tris-EDTA(TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液（由于反应性胺 而在DNA微阵列实验中使用）。在这类旋转柱（spincolumn)上的核酸的纯化包括许多复 杂和烦人的步骤。在旋转柱上的核酸纯化通常包含三个耗时和复杂的步骤/阶段： 将含核酸的样品加入柱，并且核酸由于结合缓冲液的较低的pH(相对于柱上的硅烷 醇基团）和盐浓度而结合，所述结合缓冲液可含缓冲液、变性剂（例如盐酸胍）、Triton X-100、异丙醇和pH指不剂； 用5mMKP04pH8. 0或类似物，80%EtOH洗涤该柱；和 用缓冲液或水洗提该柱。
[0014] 备选的方法涉及在离液盐的存在下的核酸结合，使得DNA结合至二氧化硅或玻璃 颗粒或玻璃珠。此性质被用于在碱性条件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠纯化核酸。典型的 离液盐包括硫氰酸胍fS或盐酸胍鶴并且最近玻璃珠已经用含玻璃的微柱取代。
[0015] 在法医学应用中针对PCR扩增失败的最好的防备在于将可靠的样品处理和加工 技术与经证明有效纯化DNA的提取系统组合。
[0016] SantosC.R?等人，（BrazilianJournalofMicrobiology, 2012，43， 389-392)描述了跳过在核酸的PCR扩增之前的洗提步骤和将冲压片（puncher)直接加入 PCR混合物的方法。该PCR扩增被实施用于检测HPV-DNA并且与在扩增之前洗提核酸的标 准的FTA洗提卡（FTAelutecard)方案相比更有效。然而此方法仅使用定性PCR测量HPV 的存在。
[0017] NozawaN?等人，（JournalofClinicalMicrobiology, 2007，45， 1305-1307)描述了将实时PCR用于检测巨细胞病毒（CMV)的方法。所述方法涉及带有纯化 的CMV的滤纸的使用和将其直接加入PCR混合物。所述论文指出只有具有光电倍增管扫描 系统的仪器可用于使用滤片的实时PCR测定。所述论文提出滤纸会不利地影响使用电荷耦 合器件相机的仪器并由此教导避免在诸如ABI7700机器等实时PCR机器中使用滤纸。
[0018] QiagenSample&AssayTechnologiesNewsletter(2010 年 3 月，15)描述了 在RNA制剂中低A26Q/A23Q比率对下游PCR处理的作用。该报道指出在RNA样品中在230nm处增加的吸光度相当经常是因硫氰酸胍（FTA洗提卡的组分并用于RNA纯化方法）的污染 所致。该实验证明当硫氰酸胍存在时RNA样品的A26(l/A23(l比率较低，但是在RNA样品中多至 lOOmM的硫氰酸胍浓度不影响实时PCR的可靠性。
[0019] 通常包含于所述标准FTA洗提卡方案中的纯化步骤可以是麻烦的并且纯化可导 致DNA的损失。因此有对用于对核酸扩增、定量和/或概况分析的改良和简化的方法的需 要，所述方法除去了对纯化步骤的需要。本发明致力于此问题并提供方法和试剂盒，其可用 于来自固体支持物，特别是纤维素衍生的支持物的核酸的单一步骤扩增。
[0020] 发明概述 本发明提供用于便于扩增DNA样品的方法和试剂盒，其可被用于按如下扩增核酸：将 固体支持物与核酸接触并在所述固体支持物存在下扩增核酸。
[0021] 根据本发明的第一个方面，提供了用于扩增核酸的方法，其包含以下步骤： i) 将包含离液盐的固体支持物与含核酸的细胞样品接触， ii) 将所述固体支持物转移至反应容器， iii) 将在固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育， iv) 扩增所述核酸以产生扩增的核酸， v) 定量扩增的核酸和任选地， vi) 使用短串联重复（STR)概况分析以产生STR分布图， 其中步骤i)_vi)在固体支持物的存在下实施。
[0022] 在固体支持物的存在下扩增核酸的优点在于减少核酸扩增所需的步骤数量，从而 节约操作员时间和方便操作员使用。
[0023] 在本发明的一个方面中，其中所述固体支持物在加入所述细胞样品之前已经在反 应容器中。
[0024] 在另一方面中，扩增方法是聚合酶链反应。
[0025] 在另一方面中，扩增方法包括逆转录聚合酶链反应、等温扩增或定量聚合酶链反 应。
[0026] 在进一步的方面中，所述核酸扩增试剂溶液包含聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸 (dNTP)、反应缓冲液和至少一种引物，其中所述引物任选用染料标记。这类染料可包括来 自GEHealthcare的荧光染料FAM? 或CyDyeDIGEFluor? (产品代码RP