一种全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置的制作方法

本实用新型涉及循环肿瘤细胞全自动检测设备领域，尤其涉及一种全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置。

背景技术：

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，其可自发或通过诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶或转移灶)脱落，进入体循环系统(如外周血)。大部分CTC进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着病灶以外的组织或器官上，进而发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。因此，CTC检测可有效地应用于体外早期诊断、预后评价、个体化治疗(包括快速临床化疗药物筛选和耐药性的检测)、肿瘤复发监测及新的肿瘤药物开发等。

常规的CTC检测分为两个步骤，即CTC富集(或捕获)步骤和CTC检测分析步骤。常用的CTC捕获技术有流式细胞技术、微流控芯片技术和免疫磁珠技术。其中，免疫磁珠技术适合在大体积上样条件下对少量的特殊细胞进行分离，对于CTC检测应用尤其有利，其操作步骤相对简单，易于实现自动化。

目前，市场上已出现的CTC富集和检测的产品或服务，大多需要手动操作；已有的自动化设备多为进口设备、且控制机构多、系统运转效率(耗时长)和通量相对较低。例如，强生公司的CellSearch系统基于免疫磁珠分选原理，只实现了检测操作的部分自动化，其中的细胞富集(或捕获)操作需要手工进行，自动化程度低，导致整个CTC检测程序的效率低下。具体而言，强生公司的CellSearch系统中具有以下不足：(1)试剂管路混用，需要清洗管路，有交叉污染风险；(2)在富集过程中，需要反复的转移CTC；(3)孵化过程是静态的；(4)需要对生物样本进行预处理；(5)通量低。

技术实现要素：

本实用新型旨在提供一种全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置，包括磁富集单元、离心单元、转移单元、染色单元和储料单元；所述磁富集单元用于富集连有磁性颗粒的循环肿瘤细胞，所述离心单元用于液体的离心，所述转移单元用于样本、试剂和材料的转移，所述染色单元用于对目标细胞染色，所述储料单元用于试剂和材料的储存。

进一步，所述离心单元和所述染色单元分别被设置于所述装置操作面上的两侧，所述转移单元被设置于所述装置操作面的上方，其可在离心单元、染色单元和储料单元之间运送样本、试剂和材料，所述磁富集单元和所述储料单元设置于装置操作面上合适的位置，以使该装置的结构尽可能紧凑。

优选地，本实用新型处理的样本为血液样本。

进一步，所述磁富集单元包括多个磁棒或磁块，可以为电磁体或永磁体；所述磁棒用于在样本液体中直接吸附并富集连有磁性颗粒的CTC，所述磁块被设置于样本液体外，并在样本液体内产生磁场，使连有磁性颗粒的CTC富集于一处。优选地，本实用新型采用磁性免疫捕获试剂，如磁珠偶联抗体，来特异性识别和结合循环肿瘤细胞表面抗原从而实现CTC的捕获和富集。

在本实用新型的一种优选实施方式中，所述磁富集单元包括多个带有无磁外套的磁棒，每个磁棒对应一个样本，当磁棒插入样本液体中富集磁性颗粒时，该无磁外套套于所述磁棒的外部，磁性颗粒会被富集在所述无磁外套的表面，当富集的磁性颗粒需要被释放时只需将磁棒从外套中抽出即可实现去磁的效果。优选地，所述磁棒只有底面具有磁性，这样可使被捕获的CTC富集在磁棒的底面。优选地，所述无磁外套的材质为塑料。

进一步，所述离心单元采用的离心机为步进式离心机，可根据需要任意移动样本的通道位置；进一步，所述步进式移动样本通道位置即：在操作者上机时在离心机上放置离心管或转移单元添加和吸取液体时，离心机可以缓慢顺时针或逆时针旋转移动，将已操作通道移走，并将相邻通道转至操作位。采用所述步进式移动样本通道位置，便于上机放置样本管，同时可以便于配合转移单元工作，使转移单元与样本通道通过最短路径配合，能够节约转移单元反复移动位置所消耗的时间，加快整个流程的进度。

优选地，所述离心单元能够实时记忆和记录每个样本通道的位置，便于将样本初始编号和提取物/分析物样本编号的对应，并且每一个生物样本在离心过程中的任意位置是有路径记忆以及动态与静态位置可设定和控制的。

更优选地，所述离心机为数字化离心机，在离心过程中，操作者可根据样本的离心要求设定加速与减速曲线，采用的减速曲线是智能可控的有刹车减速，在不扰动样本分层的基础上，能够快速刹车，节省了时间，而现有的离心机减速，为了避免样本的分层扰动，都是采取无刹车减速，减速时间非常长。

进一步，本实用新型所述离心单元还具有混匀机构，所述混匀机构被设置在离心机的每个样本通道底部，该机构可带动离心试管进行自旋和/或摇晃运动。

进一步优选地，所述离心单元还包括视觉识别系统，用于对离心液体分层的成像、各层吸取液体量和高度的计算。

优选地，所述视觉识别系统的计算方法分为两部分，均是根据视觉识别照片(上下层以光电传感器对颜色加以区分)来计算的：

1)计算需抽掉的上层液体高度值：根据样本所在高度减去照片中上层与下层相接处的高度的差，加上调整的高度(防止抽液过多对下层造成扰动)；

2)计算需添加的液体高度值：用设定的最终高度减去现有液面的高度，必要时还要减去添加目标液体之前所需添加的小剂量试剂的高度。

进一步，所述转移单元由一个或多个机械臂组成，所述机械臂能够进行上下、左右和/或转轴运动；优选地，所述机械臂可兼容hamilton的移动系统；在本实用新型的一种优选实施方式中，所述多个机械臂分别用于转移样本、废弃液、试剂和固体材料；在本实用新型的另一种优选实施例中，所述机械臂具有“一臂多用”的特点，可用于移取液体或固体材料。

在本实用新型的一种优选实施方式中，所述全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置还包括搅拌棒。优选地，所述磁棒和/或所述搅拌棒通过电磁场被所述机械臂抓取而实现转移。

进一步优选地，所述搅拌棒为螺旋桨状。

优选地，所述机械臂能带动所述搅拌棒或所述磁棒进行自转运动，从而实现搅拌和混匀的动作。

进一步，所述染色单元包括染色平台和清洗平台，所述染色平台提供免疫荧光染色试剂，用于为CTC染色，所述清洗平台提供清洗液，用于清洗杂质和多余的染色剂。

优选地，当所述磁富集单元为磁棒时，所述染色单元包括染色平台、清洗平台和磁棒支撑架，所述染色平台和所述清洗平台为装有染色液和清洗液的试管架，染色或清洗时只需将磁棒富集部位插入试管中即可。

进一步，所述储料单元包括试剂储料仓、耗材储料仓、磁棒储料仓和废弃物储料仓，更进一步还可包括搅拌棒储料仓。

优选地，所述试剂包括循环肿瘤细胞免疫捕获试剂、免疫荧光染色试剂、细胞固定试剂、缓冲液；其中，所述循环肿瘤细胞免疫捕获试剂含有可特异性识别和结合循环肿瘤细胞表面抗原的磁珠偶联抗体；所述细胞染色剂优选为可特异性识别和结合循环肿瘤细胞表面抗原的荧光抗体。进一步，所述试剂还可以包括核酸染色剂、捕获增强试剂、通透试剂中的一种或多种。

优选地，所述耗材包括一次性移液枪头。

在本实用新型的一种优选实施方式中，所述染色单元由可以上下左右移动的试管架和磁棒支撑架组成，该试管架中放置有染色试管和清洗试管，当磁棒上富集的CTC需要被清洗时，只需将清洗试管移动至对应的磁棒下方并使磁棒浸入清洗液中即可，当磁棒上富集的CTC需要被染色时，只需将染色试管移动至对应的磁棒下方并使磁棒浸入染色液中即可。可移动的不仅可以是试管架，在另一种实施方式中也可以是磁棒支撑架可移动。

进一步，本实用新型所述全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置还包括收集分析单元，磁性富集获得的循环肿瘤细胞被收集于此单元内，并可被进一步进行计数或分析。

优选地，所述收集分析单元也具有吸附磁场，当磁棒携带富集的CTC置入收集分析单元内后，将磁棒从无磁外套中抽出，同时开启收集分析单元的吸附磁场，这样连接有磁性颗粒的CTC更易被收集分析单元的磁场发生面所吸附，并平铺在该面上，有利于后续的细胞计数和分析工作。

更进一步，本实用新型所述离心单元还包括外磁系统，所述外磁系统包括永磁体或电磁体，用于对离心机内离心试管中的样本液体产生外加磁场，当免疫捕获试剂被加入样本中时，需要孵育一段时间才能促使免疫捕获试剂与CTC完全结合，在孵育的过程中可通过外加磁场来强化免疫磁捕获试剂对CTC的捕获，如通过改变外加磁场的方向来控制免疫磁捕获试剂发生定向的运动，从而从各个方向上与样本中的CTC更全面地结合。

在本实用新型的一种优选实施方式中，所述外磁系统是设置在离心试管周围不同方向的多块磁体，这些磁体可产生周期性变化的磁场来强化捕获效果。在本实用新型的另一种优选实施方式中，所述外磁系统是设置在离心机圆周上特定位置处的磁体，通过低速旋转离心机使离心试管与所述外磁系统之间的距离发生改变，从而对离心试管产生周期性变化的磁场，在磁场的作用下试管内的免疫捕获试剂会进行各个方向的定向运动，从而使免疫捕获试剂与CTC更好地结合。

此外，本实用新型还提供一种全自动循环肿瘤细胞阳性富集方法，包括以下步骤：

1)在离心单元中，将全血样本离心后，进行视觉识别与计算；弃去上清液，加入缓冲液，混匀，加入免疫捕获试剂，在外磁系统作用下孵育，然后用磁棒捕获循环肿瘤细胞；

2)在染色单元中，进行磁棒转移和清洗，加入免疫荧光染色试剂进行染色孵育，再进行清洗；

3)在收集分析单元中，进行磁棒转移，退磁，进行循环肿瘤细胞的磁转移，并进行计数或分析。

优选地，上述操作均由机械臂完成。

本实用新型具有以下有益效果：

(1)本实用新型的装置所采用的捕获原理与CellSearch系统相似(免疫磁捕获和免疫荧光染色)，但与已上市的循环肿瘤细胞阳性富集系统(例如，CellSearch)相比，其主要特点是兼容了样本前处理过程(即对血样品进行稀释，而CellSearch系统需要在上机前人工配合台式离心机对样本进行稀释处理)。

(2)本实用新型的离心单元采用步进式移动样本通道位置，便于配合机械臂工作，使机械臂与样本通道通过最短路径配合，能够节约机械臂反复移动所需时间，加快整个流程的进度；所述离心平台所用离心机的减速曲线采用智能可控的有刹车减速，与传统的离心机自由停车相比，即避免了离心停车对液体的扰动，又节约了离心时间。

(3)与CellSearch相比，本实用新型所述装置或方法的优点有：a.每个通道的样本和试剂操作是独立的，样本和试剂没有交叉污染，而CellSearch是交叉的需要清洗管道；b.CellSearch在富集过程中，需要反复的转移CTC，本实用新型在富集过程中是一次捕获，并不需要转移；c.孵化过程，CellSearch是静态的，本实用新型是动态的，有搅拌、混匀和外磁强化；d.CellSearch需要对生物样本进行预处理，本实用新型是全自动的；e.本实用新型的通道更多，更高效。

附图说明

图1是本实用新型的一个较佳实施例的结构示意图；

图2是本实用新型中机械臂的另一个较佳实施例的结构示意图；

图3是本实用新型中磁棒的一个较佳实施例的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本实用新型作进一步详细描述，但本领域技术人员根据以下实施例中具体方案的替换、转用或组合均包含于本实用新型的保护范围之内。采用与本实用新型装置类似设计流程样本处理的液体工作站形式，或者采用与本实用新型方法类似的富集方法，均在本实用新型的构思范围之内。

实施例1

本实施例提供了一种全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置(图1)，包括磁富集单元、离心单元、转移单元、染色单元和储料单元；其中磁富集单元由12支磁棒1组成；离心单元的主要部件为可同时处理12个样本的数字化离心机2；转移单元由具有横向(X)和纵向(Y)轨道的两个转移机械头3-1、3-2组成，该两个转移机械头还可在垂直操作面的方向上(Z，图中未示出)移动；染色单元包括具有滑动轨道的试管架4和可垂直操作面移动的磁棒支撑架5，在该试管架中按需设置装有染色试剂或清洗液的试管；储料单元包括试剂储料仓6、移液枪头储料仓7、废液储料仓8、磁棒储料仓9和搅拌棒储料仓10。此外，本实施例还包括收集分析单元，该收集分析单元包括可对12个样本进行收集分析的读数盒11，在该读数盒的上方也设置有磁棒支撑架12。

本实施例将离心单元和染色单元分别设置在操作平面的左右两侧，在其中间设置储料单元，转移单元被设置在操作面的上方，其移动范围可覆盖整个操作面，这种设计可优化物料的转移距离，缩短运行时间。

进一步，离心平台的离心机2为步进式离心机，可根据需要任意移动样本的通道位置，在一种优选的实施方式中，如图1所示的a和b位为机械臂的操作位，每次需要移液操作时，将样本离心管转至a和b位，两个转移机械头3-1、3-2同时移动至此位进行添加或吸取液体，固定操作位后，由于机械臂的移动路径被缩短，且机械臂和离心机同时参与位移，使总的运行流程缩短。此外该数字化离心机可根据样本的离心要求设定加速与减速曲线，采用的减速曲线是智能可控的有刹车减速，在不扰动样本分层的基础上，能够快速刹车，可进一步节省时间。该离心机还能够实时记忆和记录每个样本通道的位置，便于将样本初始编号和提取物/分析物样本编号的对应，并且每一个生物样本在离心过程中的任意位置是有路径记忆，以及动态与静态位置可设定和控制。

所述转移单元的机械臂连有两个转移机械头3-1和3-2，可以插取和释放移液枪头，吸取和吹出液体，此外还可以通过电磁场抓取、转移和旋转磁棒和搅拌棒，所述磁棒和搅拌棒的上端都设置有铁磁性物质，可被转移机械头抓取。

在本实用新型的另一种实施方式中，机械臂除了可以设置直线轨道外，还可以设置成绕轴旋转的形式，如图2所示，该离心单元有两个旋转式机械臂3-3和3-4，它们从左侧的储料仓13中移取枪头、试剂等，为离心机2提供液体转移。

本实施例中的磁棒结构如图3所示，除了上端带有铁磁性物质11以外，其底面14可释放磁场，该磁场是由磁棒内部的磁芯12释放而出的，其外部还具有无磁外套13，工作时磁性颗粒会被富集在该无磁外套13的底面，富集完成后只需将磁棒从外套中抽出即可释放磁性颗粒，此外其上部还设置有卡位部件15，用于将磁棒悬挂在磁棒支撑架上。

本实施例的离心单元还包括视觉识别系统，能够对离心液体分层的成像、各层吸取液体量和高度进行计算。

本实施例中的染色单元包括染色平台、清洗平台和磁棒支撑架5，所述染色平台提供免疫荧光染色试剂，所述清洗平台提供清洗液，它们被合并设置在同一可沿轨道滑动的试管架4上，磁棒支撑架可垂直操作面上下移动，因此要染色时只需将染色试剂移至磁棒下方，将磁棒支撑架下移使磁棒浸入染色试剂内即可，需要清洗时则将清洗试剂移至磁棒下方，即可将磁棒浸入清洗试剂进行清洗。

本实施例还包括收集分析单元，由读数盒11和磁棒支撑架12组成，通过将富集后的磁棒插入对应的读数盒内，抽出磁棒仅保留无磁外套，同时开启读数盒底面的吸附磁场，连接有磁性颗粒的CTC会被底面所吸附，并平铺在该面上，为后续的细胞计数和分析提供有利的条件。

进一步，本实施例所述离心单元还包括外磁系统(图中未示出)，所述外磁系统包括永磁体或电磁体，用于对离心机内离心试管中的样本液体产生外加磁场，当免疫捕获试剂被加入样本中时，需要孵育一段时间才能促使免疫捕获试剂与CTC完全结合，在孵育的过程中可通过外加磁场来强化免疫磁捕获试剂对CTC的捕获，如通过改变外加磁场的方向来控制免疫磁捕获试剂发生定向的运动，从而从各个方向上与样本中的CTC更全面地结合。

在本实用新型的一种优选实施方式中，所述外磁系统是设置在离心试管周围不同方向的多块磁体，这些磁体可产生周期性变化的磁场来强化捕获效果。在本实用新型的另一种优选实施方式中，所述外磁系统是设置在离心机圆周上特定位置处的磁体，通过低速旋转离心机使离心试管与所述外磁系统之间的距离发生改变，从而对离心试管产生周期性变化的磁场，在磁场的作用下试管内的免疫捕获试剂会进行各个方向的定向运动，从而使免疫捕获试剂与CTC更好地结合。

本实施例中的全自动循环肿瘤细胞阳性富集装置可同时处理12个样本，且兼容了样本前处理过程，运行时间短(满载全流程运行耗时约为2小时40分)，实现了样本的高效处理。

实施例2

本实用新型所述的视觉识别系统的一种优选实施例的具体计算方法包括两部分，分别是吸取液体高度的计算和需要添加液体高度的计算，都是根据视觉识别系统所拍摄的照片进行计算。

计算需抽掉的上层液体高度值：根据样本所在高度减去照片中上层与下层相接处的高度的差，加上调整的高度(防止抽液过多对下层造成扰动)；

计算需添加的液体高度值：用设定的最终高度减去现有液面的高度，必要时还要减去添加目标液体之前所需添加的小剂量试剂的高度。

例如，默认全血样本体积为10mL，离心后样本分为上层血浆和下层血细胞，吸取上层血浆后，需添加0.2mL的免疫捕获试剂和捕获增强试剂，然后添加稀释缓冲液至5mL，其中调整的高度为0.8mL液体对应的高度，则其计算的总步骤为两步：

1)计算需抽掉的上层血浆的高度值：10mL样本所在高度减去照片中上层血浆与下层血细胞相接处的高度的差，加上7mm的高度(0.8mL液体对应的高度)；

2)计算需添加的稀释缓冲液高度值：所需稀释缓冲液为5mL所在高度值减去抽取血浆后的液面高度与需在稀释缓冲液之前添加的0.2mL的小剂量试剂之和；

例：10mL样本中共有7mL的上层血浆，则抽取值为6.2mL(7-0.8)，需添加的稀释缓冲液为1mL(5-3.8-0.2)。

实施例3

一种全自动循环肿瘤细胞的阳性富集方法，主要包括以下步骤：

1)在离心平台，将全血样本离心后，进行视觉识别与计算；弃去上清液，加入缓冲液，混匀，加入免疫捕获试剂，在外磁系统作用下孵育，然后用磁棒捕获循环肿瘤细胞；

2)在染色平台，进行磁棒转移和清洗，加入免疫荧光染色试剂进行染色孵育，再进行清洗；

3)在收集分析单元中，进行磁棒转移，退磁，进行循环肿瘤细胞的磁转移，以便后续进一步对其进行计数和分析。。

上述操作均由机械臂完成。

具体地，所述阳性富集方法的自动化操作步骤可参见表1。

表1 CTC阳性富集自动化操作步骤

以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。